[发明专利]用于基因CDS区域一代测序的嵌套引物对、测序引物对、测序试剂、测序试剂盒及应用

说明书

本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及用于基因CDS区域一代测序的嵌套引物对、测序引物对、测序试剂、测序试剂盒及应用。通过设计开发了一对连接在特异性扩增引物前的通用嵌套引物，同时针对该引物设计了一对测序引物。该引物具备两个功能区域，通用引物序列区域的作用在于延长一代测序读取长度，获取有效的目的基因CDS序列；随机碱基序列作为桥梁序列，其作用在于区分通用引物序列和特异性扩增的目的基因序列，从而能够在扩增产物中快速识别出目的基因的CDS序列。最后，测序引物的作用是作为一代测序的通用测序引物，能够降低送测操作的复杂度。综上，本发明不仅能够缩短实验周期，同时也能降低实验成本。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及用于基因CDS区域一代测序的嵌套引物对、测序引物对、测序试剂、测序试剂盒及应用。

背景技术

一代测序又称为Sanger测序，其主要特点在于测序读长较长，一次可以读取600bps～1000bps的碱基；至今仍是正确性的金标准，准确度高达99.999％。但是，由于测序仪器初始时电流电压的不稳定因素，造成在读取5’端下游约50bps的碱基序列时荧光信号不稳定，使得不能获取有效的目的基因CDS区域序列。为了获取目的基因CDS区域序列，现在采取的主要方法是在5’端下游约100bps的碱基序列处设计一条引物进行反向测序，再通过2条序列的拼接来实现，此方法的局限性在于延长了实验周期，增加了实验成本。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种用于基因CDS区域一代测序的嵌套引物对，通过所述嵌套引物对延长一代测序的读取长度，以获取有效的目的基因完整的CDS序列。

本发明的第二个目的在于，提供与上述提供的嵌套引物对特异性结合的测序引物对，以及包含上述嵌套引物对和测序引物对的试剂及试剂盒，期望通过所述测序引物对以所述嵌套引物对为模板进行扩增，从而获得的完整有效的CDS序列。

为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供了用于基因CDS区域一代测序的嵌套引物对，所述嵌套引物对包括正向嵌套引物和反向嵌套引物，所述正向嵌套引物的核苷酸序列包括5’端至3’端顺序连接的第一通用序列和随机碱基序列，所述反向嵌套引物的核苷酸序列包括5’端至3’端顺序连接的第二通用序列和随机碱基序列，所述第一通用序列和第二通用序列的核苷酸长度为55～80bps，所述随机碱基序列的长度为5～10bps。

可选实施方式中，所述第一通用序列和第二通用序列的核苷酸长度为60bps，所述随机碱基序列的长度为6bps。

可选实施方式中，所述第一通用序列如SEQ ID No.1所示，所述第二通用序列如SEQ ID No.2所示。

第二方面，本发明提供了前述任一项实施方式所述的嵌套引物对在制备基因CDS区域测序产品中的应用。

第三方面，本发明提供了用于基因CDS区域一代测序的测序引物对，所述测序引物对包括长度均为18～30bps的正向测序引物和反向测序引物，所述正向测序引物的核苷酸序列与前述实施方式任一项所述第一通用序列5’端的核苷酸片段相同或互补；所述反向测序引物的核苷酸序列与前述实施方式任一项所述第二通用序列5’端的核苷酸片段相同或互补。

可选实施方式中，所述正向测序引物的具体核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述反向测序引物的具体核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

第四方面，本发明提供了用于基因CDS区域一代测序的通用测序试剂，所述测序试剂包括前述任一项实施方式所述的嵌套引物对和测序引物对。

第五方面，本发明提供了用于基因CDS区域一代测序的通用测序试剂盒，所述试剂盒包括前述实施方式所述的通用测序试剂和任选耗材。