[发明专利]一种基于转录组和蛋白组联合分析的棉花耐盐基因发现方法及其应用

权利要求书

1.一种基于转录组和蛋白组联合分析的棉花耐盐基因的发现方法，其特征在于，所述棉花耐盐基因包括棉花耐盐基因Gh_D10G0907和棉花耐盐基因Gh_D11G0978，所述棉花耐盐基因Gh_D10G0907和棉花耐盐基因Gh_D11G0978分别位于棉花D11和D10号染色体；

所述棉花耐盐基因Gh_D10G0907和棉花耐盐基因Gh_D11G0978的cDNA序列信息如下：

Gh_D10G0907.1

ATGGCTTCAGTGAATCTGGGCTCTTTGGTTCAATCATACTCCATTTTCAACCAAGCTTCC

AGAAACAATTCCAAGTCTTTTCCTTTACCCAGATCCTTTCCCTTCAATCCCCTCAAGAAT

ATCTCATCTTCAACTCCCAAAAGACGTAGCTTTACATCTCTTCCTTCGATATCCTCAGTC

CTTACCAAAGAAGACGCGGTCATGGAAGAAGACCAAGACCCTCAATTACCAAGTTTTGAT

TTCAAATCATTCATGATACACAAGGGTAATGCAGTTAACCAAGCCCTGGACTCGGCTGTT

CCACTCCGTGACCCTGTTAAAATCCATGAAGCAATGCGTTACTCCCTTTTAGCCGGTGGC

AAAAGGGTCCGCCCAGTTCTTTGTTTGGCTGCTTGTGACCTTGTTGGTGGCAAAGAATCC

ATGGTTATGCCAGCAGCTTGTGCTCTTGAAATGATCCACACCATGTCTTTAGTCCACGAT

GATCTTCCTTGCATGGACAACGATGATCTTCGTAGAGGGAAACCAACTAACCACAAAGTT

TATGGTGAAGATATAGCTGTGTTAGCAGGGGATGCTCTTTTAGCCTTTTCGTTTGAACAT

ATAGCTGTATCCACAGTTGGTGTCACACCTGATAGGATTGTAAGAGCAATTGGGGAATTA

GCTAAATCTATTGGGGCTGAAGGGTTGGCGGCTGGTCAAGTTGTGGATATAACCAGTGAG

GGTCTAACCAATGTGGGGTTGGATCATTTAGAATTCATTCATGTTCATAAAACTGCTCCA

TTGCTTGAAGCAGCTGCGGTTTTAGGGGCTATTCTTGGAGGTGGACATGATGAAGATGTG

GAAAAGTTGAGGAAATTTGCAAGGAATATTGGGCTTTTATTTCAAGTTGTGGATGATATT

CTTGATGTAACAAAGTCATCTAAAGAATTAGGGAAGACTGCAGGGAAAGATTTGGTGGCT

GATAAAGTGACTTATCCTAAATCGATGGGGATAAACAAATCAAAGGAGTTTGCAGAGAAG

TTGAAGAGTGATGCATTAGAGTTGCTTCAAGGGTTTGATCCTGAGAAATCTACCCCCTTA

ATTGCTTTAGCTAATTATATAGCTTACAGGCAAAATTAG

Gh_D11G0978.1

ATGTCGCAGTTGTTGGAGAAGGCGAAGGACTTCGTGGTGGATAAGGTGGCCAACATAAAG

AAGCCGGAGGCTAGTGTCTCGGACGTTGATCTGAAACATGTGAGCCGTGAGTGCGTCGAG

TATGGCGCTAAGGTCTCTGTCTCCAACCCCTACAGCCATTCCATCCCCATTTGTGAGATC

TCTTACAATTTCAAAAGTGCTGGAAGAGGGATAGCATCAGGGACAATACCAGACCCGGGG

TCATTGAAAGCCGGCGACACAACGATGCTGGACGTGCCAGTGAAGGTGCCGTATAACATC

TTAGTAAGCTTGGCAAAGGATATTGGTGCAGATTGGGACATTGACTATGAATTGGAATTG

GGTCTCACCATTGATCTTCCTATCATGGGGAACTTCACTATCCCTCTCTCTCAGAAAGGA

GAGATCAAGCTTCCTACTCTCAGTGACATCTTTTAG；

其中，棉花耐盐基因的发现方法包括以下步骤：

步骤1、蛋白组与转录组测序及联合分析；

种植耐盐棉花品种，相同环境下当棉花幼苗生长到四叶期时，选取6株生长状态良好且形态相近的幼苗分为两组，一组为对照组，一组为实验组，实验组每天下午5点浇250mmol/l的NaCl溶液200ml；对照组浇等量的蒸馏水，两天后，将对照组三株分别取真叶标记为CK1、CK2、CK3，同样将实验组3株分别取真叶标记为Salt1、Salt2、Slat3，最后将6个样进行干冰冷冻然后分别提取RNA进行转录组测序、提取蛋白进行蛋白组测序；

通过对转录组与蛋白组的联合分析，一共得到24个共性的差异表达基因，这24个基因在转录组与蛋白组结果中均显著差异表达；通过对目的基因的注释与比对，盐胁迫前后表达量差异倍数比对，并且对基因功能进行总结，得到两个显著差异表达的基因Gh_D10G0907与Gh_D11G0978，将这两个基因确定作为目的基因，并对其耐盐功能进行验证；

步骤2、耐盐基因的表达模式验证；

步骤2.1、对于上述耐盐候选基因，利用Primer5进行引物的设计并合成，将RNA反转录为cDNA，利用实时定量PCR进行表达模式验证；

步骤2.2、在棉花中开展候选基因的基因克隆与基于病毒介导沉默的功能验证，Gh_D10G0907全长1119bp编码氨基酸372个，属于GGPS家族；Gh_D11G0978全长456bp编码氨基酸151个，属于LEA家族；这两个家族在不同的物种中均有耐盐性相关验证；用VIGS技术获得了Gh_D10G0907和Gh_D11G0978的基因沉默植株，对沉默植株进行盐处理后，沉默植株出现早枯萎与较大程度的盐害表型；而且沉默植株对比对照组活性氧含量更高；则认为这两个基因在陆地棉盐胁迫下有着重要的作用。

2.一种采用权利要求1所述的发现方法的棉花耐盐基因Gh_D10G0907和棉花耐盐基因Gh_D11G0978在分子标记辅助选育棉花品种中的应用。