[发明专利]抑制GUSB活性物质在制备提高抗癌疗效药物中的应用

说明书

本发明发现了靶向抑制和或降低GUSB活性，能够提高抗癌疗效，明确的说，是能够提高抗肝细胞癌疗效，更确切的说，体内敲降GUSB与PD1单抗联用能增强肝细胞癌的免疫治疗疗效，进一步，课题组提出了一种能够体内敲降GUSB的原料药与PD1单抗的原料药在制备通过抑制GUSB活性，增强肝细胞癌中PD1单抗效果的药物中的应用,还提出了阿莫沙平的一种新用途，阿莫沙平与PD1单抗联用能增强肝细胞癌的免疫治疗疗效。本发明不仅找到了抗PD1耐药的新靶点，而且利用旧药物阿莫沙平找到了抑制该靶点的有效途径。对改善晚期HCC患者的预后具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生命健康领域，尤其是抑制GUSB活性物质在制备提高抗癌疗效药物中的应用领域。

背景技术

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的肝癌形式，是全球癌症相关死亡的第三大原因。由于大多数患者在确诊时已进入晚期，因此缺乏有效的治疗手段。免疫治疗尤其是免疫检查点封锁疗法，已在临床治疗中取得了显著的效果。其中PD1与其配体PD-L1在肿瘤免疫中发挥着重要作用，其结合后发挥的主要功能是产生抑制性信号，抑制T细胞的活化和增殖以及细胞毒性因子的分泌，从而抑制抗肿瘤免疫。而PD1单抗通过阻断这一抑制活动虽然增强了患者自身免疫系统并在治疗各种晚期恶性肿瘤方面取得了明显的进展，取得了巨大的成功，但许多临床前和临床研究表明，抗PD1治疗往往会产生耐药性，导致肝癌患者治疗失败和肿瘤复发。因此，找到抗PD1耐药的治疗方案对于改善晚期HCC患者的预后具有重要意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，针对以上问题，课题组为了找到潜在的生物标志物或抗PD1治疗反应的靶点，在南京医科大学第一附属医院收集了10例抗PD1治疗前肿瘤组织并进行基因表达分析，并比较有反应组和无反应组的测序结果。偶然间发现β-葡萄糖苷酶(GUSB)在无反应组中的表达明显高于反应组。这提示了课题组，GUSB也许在HCC免疫治疗耐药过程中起到重要作用。

GUSB是一种在大多数组织中表达的酶，并积极参与溶酶体中蛋白多糖的降解。通过催化GAGs降解的第五步，它在硫酸皮聚糖和角蛋白的降解中发挥了重要作用。GUSB还参与各种代谢物如戊糖、葡萄糖酸盐、叶绿素、卟啉、淀粉和蔗糖的阳离子结合和相互转化。在生理和炎症状态下，GUSB在细胞外基质成分的重构中发挥重要作用。

为了证明课题组的猜想，课题组对GUSB进行了深入的研究，并进行了试验。

首先，课题组构建了小鼠HCC细胞的GUSB慢病毒包装质粒(Genechem, 中国)。

小鼠HCC细胞(Hepa1-6) 由 Cell Bank of Type Culture Collection (中国科学院)提供，使用RPMI 1640培养基(美国BI)加10%胎牛血清(FBS)(美国Gibco)， 在37℃，5%CO2培养箱培养。

小鼠HCC细胞(Hep1-6)中的GUSB通过shRNA(Genechem，中国)下调。

具体方法为将Polybrene (Sigma-Aldrich，美国)和慢病毒加入到长有HCC细胞的培养皿中，加入培养基充分混合。37℃培养箱孵育3 天后，得到GUSB敲降的小鼠HCC细胞即sh-GUSB细胞。使用同样方法得到对照组sh-NC细胞。

接下来，课题组构建第一部分小鼠模型: C57BL/6小鼠皮下注射Hepa1-6细胞。将小鼠分为sh-NC、sh-NC+ PD1单抗、sh-GUSB、sh-GUSB+ PD1单抗 (bioxcell,USA)四组，每组5只。sh-GUSB+ PD1单抗组和sh-NC+ PD1单抗组均是在在第8天腹腔注射200ug PD1单抗，此后每3天注射一次。