[发明专利]一种miR181a对胰岛素抵抗的调控作用的测定方法

说明书

本发明属于医药技术领域，公开了一种miR181a对胰岛素抵抗的调控作用的测定方法，通过miR‑181a吸附海绵载体策略可以成功的诱导吸附miR‑181a，构建的pEGFP‑C2‑181a‑SP载体基因显著增加HepG2细胞的胰岛素敏感性，为改善miR‑181a导致的肝细胞胰岛素抵抗提供了潜在的解决方案，有可能成为2型糖尿病治疗的新策略；同时，通过对胰岛素含量进行测定方法采用同位素稀释质谱基准技术对样品中的胰岛素直接进行定量，定量结果准确可靠；在测定过程中不需要对胰岛素进行酶切，避免了酶切效率的影响；样品不需要分离直接进行测定，分析速度和分析通量显著优于普通方法。

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种miR181a对胰岛素抵抗的调控作用的测定方法。

背景技术

胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用来治疗糖尿病。胰岛素的主要生理作用是调节代谢过程。对糖代谢：促进组织细胞对葡萄糖的摄取和利用，促进糖原合成，抑制糖异生，使血糖降低；对脂肪代谢：促进脂肪酸合成和脂肪贮存，减少脂肪分解；对蛋白质：促进氨基酸进入细胞，促进蛋白质合成的各个环节以增加蛋白质合成。总的作用是促进合成代谢。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。作用机理属于受体酪氨酸激酶机制。然而，现有miR181a对胰岛素抵抗的调控作用的测定方法不能有效提高胰岛素敏感性；同时，不能准确测定胰岛素含量。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有miR181a对胰岛素抵抗的调控作用的测定方法不能有效提高胰岛素敏感性；同时，不能准确测定胰岛素含量。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种miR181a对胰岛素抵抗的调控作用的测定方法。

本发明是这样实现的，一种miR181a对胰岛素抵抗的调控作用的测定方法包括以下步骤：

步骤一，对成熟人源miR-181a的序列，设计在9-12位发生突变的反义序列，并重复7个拷贝，串联至pEGFP-C2真核表达载体及pGL3-Promoter载体中，通过双荧光素酶报告基因系统验证该吸附海绵的效果；

步骤二，在葡萄糖胺诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗模型中转染miR-181a吸附海绵载体，检测细胞对胰岛素刺激的应答效果；

步骤三，对胰岛素含量进行测定。

进一步，所述构建该吸附海绵的具体方法为:EcoRi及BamHi双酶切pUC57-18la-SP及pEGFP-C2空载体,经DNA凝胶电泳,回收215bp小片段及pEGFP-C3双酶切载体得到的分子片段，使用T4连接酶将两者4℃过夜连接。

进一步，所述通过双荧光素酶报告基因系统验证该吸附海绵的效果，将构建的pEGFP-C2-181aSP荧光素酶报告基因载体共转染至HEK293T细胞。

进一步，所述检测细胞对胰岛素刺激的应答效果，使用Western blot检测，通过与对照组比较条带的变化情况，得出结论。

进一步，所述对于使用的Western blot检测，成像后用ImageJ软件分析各蛋白条带的灰度值。

进一步，所述对胰岛素含量进行测定方法如下：

(1)可逆地封闭包含的氨基酸序列的Arg-Arg前体胰岛素中的赖氨酸残基，包括使所述Arg-Arg前体胰岛素接触包含缓冲液和柠康酸酐的pH6-10的溶液；部分切割所述Arg-Arg前体胰岛素，包括使所述Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应，从而获得胰岛素；并合成同位素标记的胰岛素B链肽段并配制成同位素标记的胰岛素B链肽段溶液作为内标；