[发明专利]一种半合成纳米抗体库构建方法和纳米抗体库

说明书

本申请涉及抗体库构建技术领域，尤其涉及一种半合成纳米抗体库构建方法和纳米抗体库，所述方法包括：以CDR1、CDR2和CDR3的cDNA为模板，进行第一扩增，分别得到CDR1、CDR2和CDR3的碱基序列；将FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列与所述CDR1、所述CDR2和所述CDR3的碱基序列连接，并进行第二扩增，得到目的基因片段；将目的基因片段与第一载体连接，得到第二载体；将所述第二载体进行培养后筛选，得到含有纳米抗体库的目标载体，其中，所述目的基因片段的碱基序列连接关系包括：FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4。通过FR1、FR2、FR3和FR4的抗体骨架与合成部分CDR区域，构建半合成的纳米抗体库，避免了现有纳米抗体需要通过抗原免疫接种获得，可用抗原直接筛选，快速获得人源纳米抗体，节省了成本和时间。

技术领域

本申请涉及抗体库构建技术领域，尤其涉及一种半合成纳米抗体库构建方法和纳米抗体库。

背景技术

特异性免疫应答是指某一特定抗原刺激可以从免疫系统淋巴细胞库中选择出相应的T细胞或B细胞克隆的反应，淋巴细胞与相应抗原的结合具有高度的特异性；多样性是指T细胞库或B细胞库呈高度的异质性，是许许多多特异性识别抗原细胞克隆的总和，赋予机体具有识别周围环境中数量极大的抗原种类并与之发生反应的能力。B细胞通过V、D、J基因的重排，产生大量的免疫球蛋白基因。体细胞高频突变和类别转换可以进一步增加抗体多样性。每个B淋巴细胞表达一种有功能的重链和轻链，成熟的抗体由两条相同的重链和两条相同的轻链通过二硫键连接而成，抗体重链和轻链可变区形成一个抗原结合位点，每个抗体包含两个抗原识别位点。

相对于传统四聚体抗体由两条重链和两条轻链组成的四聚体，骆驼科动物中存在一种由两条链构成的重链抗体，纳米抗体，一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，是一种约115个氨基酸左右的支架蛋白。纳米抗体虽然分子量较小，但其仍然保留了特异性、高亲和力识别抗原的能力。纳米抗体几乎可以识别传统抗体识别的抗原，如蛋白配体、激素、小分子药物和毒素分子等，对于受到结构影响，传统抗体不能识别的隐藏表位，纳米抗体表现出独特的优势。

相对于常规抗体，纳米抗体具有许多独特的优点：(1)分子量约为15kDa，这比传统抗体(～150kDa)及其Fab(～50kDa)和单链抗体(～25kDa)要小得多；(2)可溶性好，通常具有更高的热稳定性，可在细菌宿主中大量表达；(3)由于与人类3型VH结构域(VH3)的氨基酸序列高度同源，具有较高的人源化程度，降低了人类的反应原性；(4)由于其较小的尺寸和对凹形表位的偏好，可以结合常规抗体难以结合的位置。纳米抗体是通常由骆驼免疫产生，然后分离外周血淋巴细胞，扩增抗体的可变区，构建噬菌体展示免疫抗体文库。通过免疫动物构建的抗体库，由于抗体基因来源于体内，经过了抗体亲和力成熟过程，可以获得高亲和力的抗体。

免疫接种是一个耗时的过程，大型动物的饲养也需要昂贵的维护费用。纳米抗体亦可来源于未免疫的动物，相对免疫库，采用未免疫来源的B淋巴细胞构建的天然库，缺少体内的亲和力成熟过程，抗体亲和力相对较低。天然库未经过免疫，可以用于各种类型的抗原筛选，是快速和经济的抗体筛选方案。

发明内容

本申请提供了一种半合成纳米抗体库构建方法和纳米抗体库，以解决现有纳米抗体需要通过抗原免疫接种获得的技术问题。

第一方面，本申请提供了一种半合成纳米抗体库构建方法，所述方法包括以下步骤：

分别得到CDR1、CDR2和CDR3的cDNA为模板；

分别得到FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列；

以CDR1、CDR2和CDR3的cDNA为模板，进行第一扩增，分别得到CDR1、CDR2和CDR3的碱基序列；

将FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列与所述CDR1、所述CDR2和所述CDR3的碱基序列连接，并进行第二扩增，得到目的基因片段；