[发明专利]一种检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法

说明书

本发明公开了一种检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法，该方法针对PRRSV JXwn06PLP2(46～323)基因序列设计特异性引物，构建原核表达质粒pET28a(+)‑PLP2‑StrepⅡ，在E.coli BL21中实现了高效可溶性表达。经过亲和层析柱与Superdex75分子筛纯化，获得了高纯度PLP2重组蛋白，将其作为包被抗原，建立了检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法。本发明发现PLP2可作为一种新的PRRSV诊断抗原，应用其建立的抗体检测方法重复性和特异性好，能够在PRRSV感染仔猪后第3～5天检测到PLP2抗体，可用于PRRS抗体检测和早期诊断。

技术领域

本发明属于在分子生物学检测技术的领域，具体涉及一种检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)引起的一种急性、高度接触性传染病。PRRSV流行已30年，严重危害我国及世界养猪业健康发展，迄今仍未取得实质性的有效控制。目前尚无有效疫苗或抗病毒药物，建立快速、敏感的检测方法，可为PRRS预防与控制提供物质和技术支撑。PRRSV非结构蛋白nsp2具有很强的免疫原性，在感染早期即可检测到Nsp2抗体。Nsp2氨基端编码半胱氨酸蛋白酶结构域(PLP2)，含有多个抗原表位，在基因Ⅱ型PRRSV毒株间相对保守，这提示PLP2在PRRSV早期感染的诊断中具有重要价值。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法。

为了实现上述目的，本发明提供的一种检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法，包括以下步骤：

S1：包被PRRSV PLP2重组蛋白，利用ELISA包被液将PRRSV PLP2重组蛋白稀释，加入酶标板中，4℃包被过夜，其中ELISA包被液将PRRSV PLP2重组蛋白按照浓度1.6～0.05μg/ml倍比稀释；

S2：洗涤，甩干酶标板中的包被液，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；

S3：封闭，将2％BSA等多种封闭液加入酶标板中，4℃封闭10～12h；

S4：洗涤，甩干酶标板中的封闭液，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；

S5：血清孵育，将血清按1:25～1:400倍比稀释，加入酶标板中，37℃孵育20～60min；

S6：洗涤，甩干酶标板中的血清，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；

S7：酶标二抗孵育，将酶标二抗兔抗猪IgG-HRP抗体按照1:2500～1:10000倍比稀释，加入酶标板中，37℃孵育20～60min；

S8：洗涤，甩干酶标板中的酶标二抗，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；

S9：酶标板中加入TMB底物液，室温避光显色5～20min；

S10：终止反应，酶标板中加入50μL浓度为2mol/L的H₂SO₄终止反应；

S11：读取吸光值，判定检验结果为阴性或阳性，使用酶标仪读取酶标板各孔OD_450nm，当血清样本OD_450nm≥0.27，判定为阳性，反之血清样本OD_450nm＜0.27，判定为阴性。