[发明专利]基于恶性疟重组蛋白的疟疾血清学监测方法

权利要求书

1.基于恶性疟重组蛋白的疟疾血清学监测方法，其特征是：将恶性疟原虫的MSP-1₁₉作为特异性抗原包被在蛋白质芯片上，通过倍比稀释法筛选抗原并确定滤纸血洗脱血清稀释倍数和筛选抗原的最佳包被浓度，具体包括以下步骤：

S1、芯片点制：

取一张包含14个区域，每个区域含256个孔的芯片，将经过倍比稀释的PfMSP-1₉抗原通过点样仪点样于芯片的一个区域的256孔中，点样完成后，将芯片置于点样仪基片载台固定过夜，然后再将其放置于4℃冰箱内保存；

S2、滤纸干血滴样本洗脱：

将恶性疟阳性质控血清对应的20例滤纸干血滴样本和10例阴性质控对应的滤纸干血滴样本洗脱，然后从903滤纸上剪下血量20μl的滤纸并置于由PBS、0.5％牛血清白蛋白(BSA)和0.3％Tween20组成的1ml洗脱液中，于4℃轻摇过夜洗脱，洗脱液用于后续检测；

S3、确定抗原包被浓度和滤纸血洗脱血清稀释倍数：

1)将步骤S1中点制的芯片由4℃冰箱取出恢复至室温，将其与围栏贴合后加入100uL3％BSA封闭液到孔中，室温封闭1h；

2)除去封闭液，将步骤S2中的20例阳性质控滤纸血洗脱血清混合，并按照4倍稀释(1:1、1:4、1:16、1:64、1:256)，然后各取100μl加入步骤S1中点制芯片的左侧5个区域内；

3)将10例阴性质控滤纸血洗脱血清混合按步骤2)的标准稀释后加入点制芯片右侧5个区域内；点制芯片上的其他1个区域加恶性疟阳性质控品血清作阳性对照，1个区域加阴性质控品混合血清作阴性对照，2个区域做空白对照，室温反应2h；

4)使用PBS清洗3次，每次5min；除尽清洗液，将稀释后的鼠抗人IgG-Cy3和羊抗人IgM-Cy5混合二抗加入到孔中，室温避光反应1h；使用PBS再次清洗后拆出围栏，甩干芯片，采用Axon扫描仪扫描芯片，并根据检测结果筛选抗原，确定筛选出抗原的最佳包被浓度和滤纸血洗脱血清稀释倍数。

2.根据权利要求1所述的基于恶性疟重组蛋白的疟疾血清学监测方法，其特征是：步骤S1中的PfMSP-1₉抗原为三个，且倍比稀释浓度分别为：0.025μg/μL、0.05μg/μL、0.1μg/μL、0.2μg/μL、0.4μg/μL和0.8μg/μL。

3.根据权利要求2所述的基于恶性疟重组蛋白的疟疾血清学监测方法，其特征是：三个PfMSP-1₉抗原中的每个抗原的每种浓度各重复点样于芯片一个区域的256孔中4次。