[发明专利]猪瘟病毒的多聚体疫苗及其制备方法

说明书

本发明公开了猪瘟病毒的多聚体疫苗及其制备方法，属于生物制品领域。本发明公开的疫苗活性成分为由融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG和融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG连接而成的蛋白质。还提供该蛋白质的制备方法，包括在生物细胞中表达融合蛋白(CSFV‑E2)‑SpyTag‑HIgG和融合蛋白CRM197‑SpyCatcher‑LIgG的编码基因，得到上述蛋白质的步骤。本发明利用蛋白质工程的方法，将SpyTag融合在E2和Fc蛋白中，与白喉毒素突变体CRM197融合SpyCatcher进行共表达，最后形成免疫刺激物聚体E2蛋白，状态更稳定，免疫效果更好。

技术领域

本发明属于生物制品领域，具体涉及一种预防猪瘟的多聚体疫苗及其制备方法。

背景技术

猪瘟俗称“烂肠瘟”，是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒(Hogcholera virus，Swine fever virus，简称CSFV)引起的一种急性、发热、接触性传染病，具有高度传染性和致死性。猪是该病毒唯一的自然宿主。该传染病于1833年首次发现于美国俄亥俄州，百余年来其流行遍及全球。国际兽疫局将其定为A类传染病，中国《动物防疫法》将其列为一类传染病，是目前危害中国养猪业发展的主要疫病之一。中国猪瘟兔化弱毒疫苗在防治猪瘟中曾起到决定性作用，但近几年来出现免疫效果不理想。

CSFV为有囊膜病毒，40～60nm，单股正链RNA。CSFV基因组长约123kb，仅含有一个大的开放性阅读框架(ORF)，此ORF翻译成含3898个氨基酸残基、分子量约438kD的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为成熟蛋白。CSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由该ORF所编码，共编码4个结构蛋白(C、E^rns(E0)、E1和E2)和8个非结构蛋白(N^pro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。在结构蛋白中，最具有免疫防治研究价值的是E0和E2，尤其E2蛋白是目前亚单位疫苗首选蛋白。

E2蛋白是CSFV的囊膜糖蛋白，是主要的抗原蛋白。在体外，E2可诱导产生病毒的中和抗体，在体内可诱导产生抗CSFV的攻击抗体。由于糖基化程度不同，E2的分子量可为51～58kDa。E2分子内的15个半胱氨酸(Cys)残基在属内均保守，其中N端6个Cys残基参与抗原结构域的形成，C端9个Cys残基则参与同源、异源二聚体的形成。

白喉毒素是一种蛋白，由535个氨基酸组成，共有两个亚基，亚基间通过二硫键连接。分子量为62kD，含有两个与有14个氨基酸的环相结合的双硫桥，分子具有毒性及产生特定免疫力的特征。白喉毒素197是白喉毒素一个突变体，其52位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸，使毒素丧失活性，对细胞不产生毒性作用，但其抗原和免疫活性仍然与天然毒素一致。

IgG融合蛋白主要特点是包含Fc段，与单克隆抗体Fc功能类似。融合蛋白可以延长蛋白的半衰期，当Fc与Fc受体(FcRn)结合，在受体的保护下，半衰期可延长至21天。同时提高分子量，降低身体清除率，Fc通过二硫键连接形成二聚体，对补加轻链免疫刺激物进一步改造可以形成聚体复合物，提高分子稳定性，同时Fc结构与免疫细胞表面的Fc受体结合，发挥IgG和白喉毒素各种生物学功能，主要包括调节细胞因子分泌、调节B细胞增值分化及提高抗体滴度等。除此之外，Fc可以特异性地与ProteinA结合，简化纯化步骤，在生物制品中有重要意义。

SpyTag是一个多肽段，SpyCatcher是与之相对应的一个蛋白质，二者能够重组，并自发形成异肽键偶联，这就将蛋白质组装和化学反应结合在一起，是可以基因编码的化学反应。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何提高猪瘟E2亚单位疫苗的稳定性和/或延长其半衰期，增强其免疫效果。

为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供蛋白质，所述蛋白质由融合蛋白(CSFV-E2)-SpyTag-HIgG和融合蛋白CRM197-SpyCatcher-LIgG连接而成，