[发明专利]一种适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.根据尿嘧啶生物合成相关基因pyrG和pyrE的外显子序列，分别选取核酸序列为如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的靶标位点locus505和locus86；

S2.以pFC334载体为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.4所示的引物对进行PCR，分别扩增得到核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示的片段；以pFC334载体为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.4所示的引物对进行PCR，扩增得到核苷酸序列如SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12所示的片段；分别以核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12所示的片段为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对进行融合PCR，扩增得到核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的sgRNA表达框；

S3.以限制性内切酶PacI单酶切pFC332载体，利用一步克隆法将S2步骤所得的sgRNA表达框片段分别连接至pFC332载体上，连接产物转化至TG-1大肠杆菌感受态细胞中，经氨苄霉素抗性筛选、菌落PCR筛选以及测序验证后，得到适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体。

2.一种根据权利要求1所述的构建方法构建得到的适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体。

3.如权利要求2所述的适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体在拟轮枝镰孢菌尿嘧啶生物合成基因研究中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

将如权利要求2所述的适用于拟轮枝镰孢菌的CRISPR/Cas9载体通过聚乙二醇介导的原生质体转化方法导入拟轮枝镰孢菌的原生质体内，先用潮霉素抗性平板筛选后，再用5-氟乳清酸抗性平板筛选，挑取转化子扩大培养后提取基因组，测序后与野生型菌株的序列比对，分析靶标基因的突变位点，结合观察突变体的表型，验证尿嘧啶生物合成相关基因的功能。