[发明专利]一种双/多重功能的非天然氨基酸及其偶联物和应用

说明书

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种具有双/多重功能的非天然氨基酸及其重组蛋白、应用。本发明式I结构的非天然氨基酸可高效、定点的引入到蛋白的任意位点，通过快速、高效、条件温和的反应实现蛋白与包括荧光、核素、药物、聚乙二醇(PEG)以及核酸等效应分子的定点偶联，制备定点修饰且质量均一的双/多偶联物，该偶联物具有低成本，低免疫原性，生产简单的潜在优势。双/多重功能重组蛋白可应用于高信噪比肿瘤成像，双模态肿瘤诊疗一体化以及抗体药物偶联介导地肿瘤杀伤等临床应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种双/多重功能的非天然氨基酸及其偶联物和应用。

背景技术

治疗性蛋白质，比如抗体，激素和干扰素等在各类疾病治疗领域发挥着重要的作用，但是一些具有疗效低，半衰期短，免疫原性高以及制备复杂等固有缺陷的天然治疗性蛋白(native therapeutic proteins)已无法满足目前的科研和临床的需求。几十年以来，随着蛋白质工程基因工程技术的不断发展，涌现出来了众多的蛋白质的偶联修饰策略，尤其是位点选择性的修饰。虽然位点特异性蛋白单个位置标记在研究蛋白药物表达，细胞内蛋白定位，运输以及构象变化已取得了较大的进展，但是随着对疾病的深入研究，对发病机制不断趋于复杂化的认识以及对精准个性化医疗的需要，蛋白质的单一修饰已经不能够满足当前需求，比如当监测单个蛋白质的精确构象变化或研究蛋白质-蛋白质相互作用时，单位点蛋白质标记可能是不够的；比如偶联单一类型抗癌药物的ADC仍然存在疗效低、耐药等问题，阻碍了其在治疗中的进一步应用。此外，蛋白药物分子(如抗体)进行治疗过程中结合显像剂进行实时监测的新型治疗策略的需求也在不断增加。因此蛋白质的双修饰或者多修饰在实现多功能蛋白药物的开发方面变得尤为重要。

目前实现蛋白质多修饰，尤其是定点多修饰策略研究相对较少，大都采用对天然蛋白的随机修饰(氨基或巯基)；糖基化修饰；融合表达蛋白；通过一些酶催化标记，比如引入亲和标签(SNAP/CLIP-tag)，识别或引入特殊多肽片段；还原二硫键等方法的组合模式引入一些可发生反应的“把手分子’，往往得到标记效率低、产品混杂不均一、修饰位点较为局限、还原二硫键或者引入巯基会使得蛋白质不稳定及大体积标签蛋白的引入的产品影响功能的发挥，较大程度上限制了它们的进一步发展。通过利用基因密码子拓展技术可将两套或三套相互正交的aaRS-tRNA对，通过三联或者四联终止密码子实现两种相互正交官能团(比如叠氮和炔基，叠氮和四嗪，叠氮和酮基，四嗪和降冰片烯)氨基酸的双插入甚至三插入，但是低效率的插入，反应效率差以及多个终止密码子的连续引入的缺点极大限制了该技术在治疗蛋白领域中的大规模应用。举例如下：

1.合成策略实现蛋白质双功能化

(1)在两个不同的位点

在蛋白质表面对两个罕见的氨基酸残基分别修饰是实现蛋白质双修饰的最直接的方法，而两种不同的单功能化修饰方法的组合需要满足严格的选择性，以确保修饰的正交性、兼容性以及较高的修饰率。Gaunt及其同事开发了一种用高价碘试剂标记蛋白质中甲硫氨酸残基的化学选择性标记方法，实现了对甲硫氨酸的位点特异性标记，将该方法与马来酰亚胺和半胱氨酸残基上巯基的反应相结合实现了对GTP结合蛋白片段Gα的双功能化(Nature 562,563–568(2018))。类似的，Paavola及其同事将半胱氨酸的修饰与磷酸吡哆醛介导的蛋白质N-端转氨基反应相结合，实现了对谷氨酰胺结合蛋白的的双荧光团标记，并通过FRET的效率监测配体介导的构象变化(Biosensors and Bioelectronics,2010,26(1):55-61)。

而另外一种替代策略则是基于游离型半胱氨酸和氧化型半胱氨酸的反应活性不同，实现蛋白质的位点特异性双修饰。Weil课题组先用马来酰亚胺对游离型的半胱氨酸进行了修饰，接着通过二硫键还原反应使氧化型半胱氨酸产生两个游离的巯基，再利用烯丙基苯砜实现游离巯基的修饰。但这一方法的局限性在于巯基与马来酰亚胺的反应必须在烯丙基苯砜修饰二硫键之前进行，否则烯丙基苯砜也会和游离的巯基反应而产生不均一的产物(Bioconjugate chemistry,2017,29(1):29-34.)。