[发明专利]一种猪链球菌高效转座突变系统及其应用

说明书

本发明公开了一种猪链球菌高效转座突变系统，所述转座突变系统，即pSET4s‑Tn质粒，包括：(一)猪链球菌温敏复制元件Ts ori；(二)大肠杆菌复制元件ColE1ori；(三)Mariner转座酶表达盒；(四)壮观霉素抗性表达盒(Spc^R)；(五)上游和下游均包含一个转座酶识别序列(IR)的红霉素抗性表达盒(Erm^R)。利用该转座突变系统可实现在猪链球菌中的高效转座突变，在单次实验中能够达到98％以上的猪链球菌为转座突变体，转座子插入在猪链球菌基因组中TA碱基位点，且转座插入位点无明显偏好性。

技术领域

本发明属于基因突变技术领域，具体涉及一种猪链球菌高效转座突变系统及其应用。

背景技术

猪链球菌是一种重要的人兽共患病原细菌，可引起猪的脑膜炎、关节炎和败血症等，给养猪业造成巨大经济损失，也可感染人导致中毒休克样综合征，死亡率较高，危害公共卫生安全。开展猪链球菌的病原生物学和功能基因组学研究对鉴定新型抗菌药物靶点以及发现疫苗候选抗原具有重要意义。

对病原菌进行高效、快捷的遗传操作是研究病原菌生长、代谢和致病机制的关键，因此开发猪链球菌的遗传操纵工具对该病原菌的病原学和致病机制研究具有重要意义。目前，在猪链球菌中，常用的基因突变菌株的构建方法是采用传统的同源重组来实现，其可以定向缺失基因组的特定片段或将目的片段定向插入染色体特定位点。但是，该方法无法实现高通量突变体构建，也不能实现随机突变。

随机转座突变技术是通过转座子随机插入到染色体中，破坏插入位置原有基因的结构，导致基因突变的一种遗传操作。近年来，将随机转座突变技术与二代DNA测序技术相结合开发出的转座插入测序技术为全基因组范围内筛选功能基因提供了新的思路。在猪链球菌中，有研究使用Tn917转座子进行转座突变，但该转座子被认为具有一定的插入偏好性。因此，本研究构建了一种猪链球菌高效转座突变系统pSET4s-Tn，其携带Mariner转座酶以及包含红霉素抗性表达盒的插入元件，通过本研究构建的转座突变系统可以实现在猪链球菌中高效构建转座突变体，转座子插入在细菌染色体的TA位点，且插入位点无明显偏好性。目前并未检索到猪链球菌中有类似的高效随机转座突变系统。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种猪链球菌高效转座突变系统，利用该系统可高效构建猪链球菌转座突变体及突变体文库。

为了达到上述目的，本发明技术方案如下：

一种Mariner转座酶表达盒，包括一个gapdh基因启动子和Mariner转座酶的编码序列，其在猪链球菌中表达Mariner转座酶，所述gapdh基因启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示，所述转座酶基因Mariner的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

一种猪链球菌高效转座突变系统，包含由上述的Mariner转座酶表达盒、抗性表达盒组成的基因片段Tn，以及质粒，所述抗性表达盒由抗性基因及两侧的转座酶识别序列组成，两侧的所述转座酶识别序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，抗性表达盒可被Mariner转座酶识别后将该抗性表达盒插入至猪链球菌染色体的TA碱基位点。

进一步地，所述抗性表达盒为红霉素抗性表达盒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

而且，所述红霉素抗性表达盒使得含有该质粒的猪链球菌具有红霉素抗性。

进一步地，所述基因片段Tn的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述基因片段Tn插入pSET4s质粒中形成所述猪链球菌高效转座突变系统，即pSET4s-Tn质粒。

进一步地，所述pSET4s质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，含有如下基因片段：猪链球菌温敏复制元件Ts ori、大肠杆菌复制元件ColE1 ori、壮观霉素抗性表达盒。