[发明专利]基于纳米酶探针的DMP和DBP快速可视化检测方法

权利要求书

1.基于纳米酶探针的DMP和DBP快速可视化检测方法，其特征在于：包括如下方法步骤：

步骤一：制备试剂盒

制备基于纳米酶探针的DMP和DBP试剂盒，该试剂盒包括微孔板、DMP和DBP标准品溶液、DMP和DBP干粉免疫信号探针、PBS缓冲液及底物显色液，包括第一标准液区、第二标准液区、DMP样品检测区及DBP样品检测区；

步骤二：检测反应

反应前用PBS缓冲液对每个单元微孔进行洗涤，在试剂盒的DMP样品检测区和DBP样品检测区的单元微孔中，先平行加入50μL DMP和DBP不同浓度标准品，每孔再加入50-200μLPBS复溶的干粉免疫信号探针，孵育反应10-20min，除去微孔中反应溶液，每孔采用PBS缓冲液洗涤，加入底物显色液50-300μL，显色5-10min。

步骤三：可视化检测

图像采集终端的摄像头捕获到不同标准品微孔所呈现的蓝图像，将收集到的颜色图像信息传输给数据收集处理模块，将图像信息转化成数据信息，即将微孔所呈现蓝色图像转化成B值，根据获取添加不同标准品的微孔所呈现蓝色的B值，通过DMP和DBP的浓度与相应的B值，构建DMP和DBP的标准曲线，未知样品浓度可根据待测样品孔的B值，经标准曲线计算获得样品的浓度，最终将检测数据在手机或ipad平板的数据输出终端显示，即实现可视化检测数据的读取。

2.根据权利要求1所述的基于纳米酶探针的DMP和DBP快速可视化检测方法，其特征在于：所述的微孔板为96微孔板，DMP和DBP分别为48微孔，所述的第一标准液区和DMP样品检测区单元微孔被DMP包被原包被，所述的第二标准液区和DBP样品检测区单元微孔被DBP包被原包被。

3.根据权利要求1所述的基于纳米酶探针的DMP和DBP快速可视化检测方法，其特征在于：DMP和DBP的标准品先用乙醇溶解，后用PBS缓冲液稀释，保持乙醇体积比为5-15％，浓度梯度均设置为0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10、50、100、500μg/L。

4.根据权利要求1所述的基于纳米酶探针的DMP和DBP快速可视化检测方法，其特征在于：所述的干粉免疫信号探针是以纳米酶Pt@Au材料为载体的免疫信号探针，包块DMP和DBP的免疫信号探针，制备方法包括：取离心管2只，分别加入3.0mL稀释10倍的Pt@Au纳米材料，采用0.2M K₂CO₃调节Pt@Au纳米材料pH到8.8，按比例依次添加20μg DMP抗体、40μg DBP抗体，反应1h后，再加入30μL PBS缓冲液，反应30min封闭Pt@Au多余位点后，孵育反应后10000r/min离心20min除去游离的抗体或蛋白，对两种Pt@Au@Ab探针进行冻干处理，获得两种Pt@Au@Ab探针冻干粉，分管充氮包装，备用。

5.根据权利要求4所述的基于纳米酶探针的DMP和DBP快速可视化检测方法，其特征在于：所述的纳米酶Pt@Au材料制备方法包括：摩尔浓度为20mM的K₂PtCl₄和HAuCl₄溶液，混合比例为0.9mL：0.1mL，混合后加入0.55mL，20mM的抗坏血酸，加入0.08mL，1mM的PluronicF127，混合液在室温下水浴超声反应3h，产物经10000r/min离心20min分离，用乙醇与水反复洗涤除去残留的Pluronic F127，超纯水复溶后，获得Pt@Au纳米材料浓度为15-25mM，浓度以Pt量计。

6.根据权利要求1所述的基于纳米酶探针的DMP和DBP快速可视化检测方法，其特征在于：所述的底物显色液为TMB溶液，初次溶解的溶剂为DMSO或乙醇，使用时超纯水稀释最终的浓度为0.1-1.0mM。

7.根据权利要求1所述的基于纳米酶探针的DMP和DBP快速可视化检测方法，其特征在于：所述的PBS缓冲液为0.01M，pH 7.4，含10％BSA。