[发明专利]一种诱导Tregs得到胚胎抗原特异性iTregs的刺激因子、培养基及方法和应用

说明书

本发明涉及一种诱导Tregs得到胚胎抗原特异性iTregs的刺激因子、培养基及方法和应用，属于细胞体外诱导培养技术领域。本发明提供了诱导Tregs得到胚胎抗原特异性iTregs的刺激因子，所述刺激因子包括雷帕霉素、重组人肿瘤生长因子‑β和绒促性素。本发明所述刺激因子能够诱导得到数量充分，并可根据需要扩增到治疗数量的胚胎抗原特异性iTregs；本发明诱导得到的胚胎抗原特异性iTregs比Tregs具有更强的胚胎抗原特异性、自身稳定性及免疫抑制功能。本发明诱导得到的人外周血胚胎抗原特异性iTregs在维持母胎免疫耐受，抑制母胎免疫排斥方面有广阔的临床应用价值。

技术领域

本发明涉及细胞体外诱导培养技术领域，具体涉及一种诱导Tregs得到胚胎抗原特异性iTregs的刺激因子、培养基及方法和应用。

背景技术

复发性妊娠丢失(Recurrent Pregnancy Loss，RPL)指患者与同一性伴侣连续发生2次及2次以上自然流产，在育龄妇女中发病率约为5％，此类患者再次妊娠失败率高达50％以上。RPL病因复杂，临床上约50％与染色体异常、生殖系统解剖异常、内分泌异常、感染和血栓形成倾向有关，另有50％RPL患者病因不明，称原因不明复发性流产(URSA)，被认为与母胎免疫排斥有关，是目前亟待解决的难治性不育症。

自2007年，申请人开始URSA的临床及基础研究，发现：1)URSA患者存在Tregs数量降低，Th17/Treg免疫失衡，提出“URSA患者Th17/Treg免疫失衡”理论^[1]。2)相对于既往的破膜检测Foxp3确定Tregs的表达水平，采用CD4⁺CD25⁺CD127^dim/-作为Tregs的表面标志，发现细胞表面标志CD4⁺CD25⁺CD127^dim/-的检测结果与Foxp3检测结果相一致，能够简单、高效检测Tregs的表达水平，为目前临床及科研检测所采用，为URSA患者病因学筛查提供了可靠依据^[2]。3)URSA患者Tregs调控Th17细胞^[3]、巨噬细胞功能异常^[4]。4)转输正常孕鼠体外扩增的Tregs能降低rIL-17所致的胚胎丢失^[5]。5)种植期Tregs水平、体外倍增的能力以及细胞因子的分泌与种植成败关系密切，反复妊娠失败患者种植期外周血Tregs表达降低^[6]。6)Tregs免疫治疗URSA患者，提高了抱婴率^[7]。5)TregsPD-1、HLA-G的表达异常与URSA密切相关^[8,9]。研究结果均提示与最初的研究假设高度一致，即：Tregs在母胎免疫耐受中发挥“调控师”的作用，而URSA患者Tregs数量、功能异常，导致母胎免疫耐受失调，参与URSA发病。

接触精液或胚胎抗原后，Tregs转化为胚胎抗原特异性iTregs，在孕期发挥更强大的母胎免疫耐受作用。妊娠期间，母体针对胚胎抗原特异性的Tregs大量扩增，其数量及功能的减少与复发性流产、产前子痫及早产及密切相关^[10]。

目前尚无研究进行胚胎抗原特异性Tregs的分选、扩增及培养的相关研究。限制因素有几方面：一、母体的胚胎抗原特异性Tregs只有在接触精液或胚胎抗原后才由Tregs转化而来；二、Tregs仅占外周血单个核细胞1％左右，占外周血CD4⁺T细胞2％～8％，故能够分离出来用于治疗的细胞数量非常少^[11]；三、Tregs表型多样，分离纯化及扩增过程中，Tregs纯度及稳定性降低^[12]。

目前并没有一种来源更充足、表型及功能稳定的胚胎抗原特异性iTregs的制备方法。

参考文献：