[发明专利]一种ramB突变体及其构建赖氨酸生产菌株的方法

说明书

本发明涉及生物技术和基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种RamB的突变体，以及利用该突变体构建L‑赖氨酸生产菌株生产L‑赖氨酸的方法。本发明通过对RamB进行突变，获得了能够显著提高L‑赖氨酸的产量的RamB突变体，并利用该突变体构建L‑赖氨酸的高产菌株，对于降低L‑赖氨酸的生产成本具有较高的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术和基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种RamB的突变体，以及利用该突变体构建L-赖氨酸生产菌株生产L-赖氨酸的方法。

背景技术

L-赖氨酸，简称L-赖氨酸，是人类和动物营养中最重要的必需氨基酸，被广泛应用于医药、食品、动物饲料和化妆品等行业中。目前，L-赖氨酸的主要生产为微生物发酵法，谷氨酸棒杆菌是目前工业中最重要的生产菌株。

随着生物技术的不断发展，近年来，对谷氨酸棒杆菌进行遗传改造以提高其L-赖氨酸产量的方法也不断出现，包括L-赖氨酸合成途径的改造，加强四碳回补途径，加强L-赖氨酸外排等等，如CN1206342C报道通过增强dapA基因、lysC基因、dapB基因、pyc基因和lysE基因的表达，从而使菌株中的L-赖氨酸产量增加。当前L-赖氨酸工业生产菌株的产酸能力已达到较高的水平，但菌株的产量尚未达到理论最大转化率。

RamB是谷氨酸棒杆菌中参与乙酸代谢的转录调控因子，在以葡萄糖为碳源生长时，RamB负调控磷酸转乙酰酶基因pta、异柠檬酸裂解酶基因aceA、苹果酸合酶基因aceB、乙酸激酶基因ack（Robert G , Annette C , Petra D , et al. RamB, a noveltranscriptional regulator of genes involved in acetate metabolism ofCorynebacterium glutamicum. Journal of Bacteriology, 2004）。CN101374953B报道了敲除ramB基因可以增加磷酸转乙酰酶Pta的活性从而提高谷氨酸的产量。然而，RamB在细胞中存在复杂的调控关系，同时包括转录激活和转录抑制调控，简单的ramB敲除对L-赖氨酸产量提高有限，因此本领域需要进一步开发RamB的突变体，以便更好地提高菌株的L-赖氨酸产量。

发明内容

针对上述问题，发明人经过广泛而深入的研究，对来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的RamB进行突变，获得了系列RamB突变体，该突变体能够显著提高L-赖氨酸的产量，从而获得L-赖氨酸的高产菌株。在此基础上完成了本发明。

本发明首先提供一种RamB突变体，相对于SEQ ID NO：1所示的野生型RamB而言，存在下述突变：M80V，Q104R，S317T且W388R；S70P且V200D；D297G且F367L；Q376R；N86S，P134S，E263V，H417R且C358R；或者Q77L。

进而本发明提供编码所述RamB突变体的核酸分子，所述核酸分子是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；或者是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA；优选地，所述核酸分子为编码所述RamB突变体的基因。

本发明提供含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌。其中，所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体，所述重组表达载体包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段，优选地在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用，更进一步包括增强子，如翻译增强子或转录增强子。