[发明专利]一种包含人NGLY1基因的重组质粒、工程菌以及人工NGLY1的制备方法和检测方法

说明书

本发明涉及人NGLY1基因和人工NGLY1技术领域，尤其涉及一种包含人NGLY1基因的重组质粒、工程菌以及人工NGLY1的制备方法和检测方法，一种检测人工基因突变体NGLY1活性的检测方法，包括以标准N‑糖蛋白RNase B为底物，以人工正常NGLY1为对照，具体步骤如下：步骤1）底物变性：将RNase B置于恒温金属浴中，80‑100℃，5‑10 min使RNase B变性；步骤2）酶切反应：1~2μg热变性后的RNase B冷却至室温后，分别加入1~2μg纯化后的人工基因突变体NGLY1和对照组的人工正常NGLY11‑2μg/μL，定容20~30μL，在35~37℃下水浴反应8‑12 h；步骤3）取反应产物用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDS‑PAGE及质谱MALDI‑TOF·MS鉴定。

技术领域

本发明涉及人NGLY1基因和人工NGLY1技术领域，尤其涉及一种包含人NGLY1基因的重组质粒、工程菌以及人工NGLY1的制备方法和检测方法。

背景技术

蛋白质N-糖基化是真核生物最常见的一种翻译后修饰，参与维持N-糖蛋白的结构与功能，并且与肿瘤、感染和免疫疾病等相关；N-糖苷酶具有对N-糖蛋白去糖基化的作用，在真核生物中广泛分布，人N-糖苷酶简称为NGLY1，NGLY1参与清除细胞内错误折叠的N-糖蛋白，能完整切割糖蛋白或者糖肽上的N-糖链，当编码NGLY1基因出现突变并且影响到产生的NGLY1活性的时候，人体内糖蛋白和糖肽的N-糖链代谢就会受到严重影响，引起一系列相关症状，由于不是所有突变能会产生NGLY1活性的变化，因此对NGLY1活性的检测结果对疾病的诊断、预测病情进展，设定治疗方案有重要作用。

中国专利CN104974994B公开了“一种用于N-糖蛋白去糖基化的糖苷酶及其应用”的N-糖苷酶能够将不同糖链结构类型(高甘露糖型糖链、复合型糖链、杂合型糖链)的N-糖蛋白上的糖链完整切除，并且它能够切除α-1,3-核心岩藻糖化的N-糖蛋白的糖链，可以用于N-糖链结构分析、糖链的功能分析，为糖生物学以及生物医药的研究提供一种新的工具酶；但该专利并未涉及人体内相关N-糖苷酶活性的检测方案。

发明内容

为了补充现有专利中无人体内NGLY1活性检测方案，本发明提供一种包含人N-糖蛋白去糖基化的糖苷酶NGLY1基因的重组质粒的制备方法；用该方法制备的包含NGLY1基因的重组质粒具有能导入工程菌诱导生产人工NGLY1的功能。

本发明以以下方案实现：

一种包含人N-糖蛋白去糖基化的糖苷酶NGLY1基因的重组质粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将正常NGLY1基因序列通过基因合成得到重组质粒一70-100μg/μL，将NGLY1基因突变患者的基因序列通过定点突变方法得到NGLY1突变基因的两条互补单链70-100μg/μL；

(2)将步骤(1)得到重组质粒一1～3μL、DNA聚合酶混合物20～30μL和NGLY1突变基因的两条互补单链各1.5μL、蒸馏水21μL，混匀，扩增参数为：95～98℃1～3min，95～98℃3～5s、55～65℃1～2min、65～70℃5～15s、循环20～30次，70～75℃5～10min、循环一次；

(3)用PCR产物纯化试剂盒纯化步骤(2)得到的PCR产物，获得含正常NGLY1基因序列及NGLY1基因突变体的重组质粒二；

(4)将步骤(3)制得的混合重组质粒二用剪切酶试剂盒剪切去除正常NGLY1基因序列，得到仅含NGLY1基因突变体的重组质粒三。