[发明专利]一种高活性突变果胶裂解酶及应用

说明书

一种高活性突变果胶裂解酶及应用，具体为突变果胶裂解酶PGLA‑rep4、突变果胶裂解酶PGLA‑rep1、突变果胶裂解酶PGLA‑rep2，本发明改造后的果胶裂解酶酶活力提高，在制浆、造纸、纺织、饲料等领域具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种高活性突变果胶裂解酶及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

果胶酶是一类能催化分解植物中果胶质(由D-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键聚合而成)的酶的总称，主要包括果胶酯酶、聚甲基半乳醛酸酶、聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸裂解酶和聚甲基半乳糖醛酸裂解酶等。如果根据应用领域和最适pH值来分类，果胶酶通常可以分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。酸性果胶酶一般指聚半乳糖醛酸酶，其最适pH值为3.5～5，主要应用于果胶的提取和酒类的澄清。碱性果胶酶一般指聚半乳糖醛酸裂解酶，其最适pH值为8～10，它能通过反式消去的作用方式断裂果胶质分子的α-l,4糖苷键，将聚合物果胶质分解成小分子半乳糖醛酸。

中国专利文献CN108588061A(申请号：201810396518.X)公开了一种比酶活及热稳定性提高的低温碱性果胶裂解酶突变体。该果胶裂解酶突变体是将野生型低温碱性果胶裂解酶的第184和第185位上的谷氨酸和赖氨酸突变为天冬氨酸和丝氨酸，显著提高了低温碱性果胶裂解酶的比酶活及热稳定性。该发明涉及的定点突变提高碱性果胶裂解酶比酶活的方法与本发明提高碱性果胶裂解酶酶活力的方法有所不同。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种高活性突变果胶裂解酶及应用。

本发明提供的突变果胶裂解酶PGLA-rep4、突变果胶裂解酶PGLA-rep1、突变果胶裂解酶PGLA-rep2酶活力明显提高。

本发明技术方案如下：

一种突变果胶裂解酶PGLA-rep4编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种突变果胶裂解酶PGLA-rep4的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，包含上述突变果胶裂解酶PGLA-rep4编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。

一种重组菌，包含上述突变果胶裂解酶PGLA-rep4编码基因的核苷酸序列，如SEQID NO.1所示。

一种含突变果胶裂解酶PGLA-rep4基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)将合成的pET-28a(+)-PGLA质粒通过正向PCR扩增pET-28a(+)-PGLA-4基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)通过正向PCR扩增rep4基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(3)将步骤(1)中制得的pET-28a(+)-PGLA-4基因片段与步骤(2)制得的rep4基因片段进行无缝克隆连接，得到重组质粒pET-28a(+)-PGLA-rep4；

(4)制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将步骤(3)制得的重组质粒pET-28a(+)-PGLA-rep4转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含突变果胶裂解酶PGLA-rep4的大肠杆菌工程菌。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，正向PCR扩增以pET-28a(+)-PGLA质粒为模板，扩增引物的核苷酸序列如下：

F1:ATCTATATCGATGGTACCATCACCC SEQ ID NO.5；

R1:ACCCCCCGCACCGCCTGT SEQ ID NO.6；

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：