[发明专利]一种半叶马尾藻SSR标记及其扩增引物、检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种半叶马尾藻SSR标记及其扩增引物、检测方法和应用。本发明利用基因组survey测序获得的半叶马尾藻序列，获得14个具有高度多态性SSR标记，编号分别为S12、S16、S24、S31、S33、S39、S41、S53、S58、S72、S74、S85、S108和S143。本发明所述的SSR标记，具有多态性强，杂合度高的特点，在对遗传多样性较低的半叶马尾藻群体进行多样性评估时有极强的优势。本发明的SSR标记扩增引物和检测方法可用于半叶马尾藻种群遗传多样性分析，并在半叶马尾藻种群鉴定方面具有应用前景。

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种半叶马尾藻SSR标记及其扩增引物、检测方法和应用。

背景技术

海洋是人类获取优质蛋白的“蓝色粮仓”。我国亚热带海域面积广阔，生境复杂多样。近年来，由于环境的变化和人类活动的影响，我们沿海地区的生境正在承受巨大的压力。珊瑚礁生态系统是海洋中的一个重要生态系统，也是满足人民生活的海产品重要来源，但是近年来，珊瑚礁海域生态系统功能严重退化。马尾藻是珊瑚礁生态系统的重要成员之一。近年来，随着我国水产养殖业的高速发展，国内市场对马尾藻的需求量越来越大；然而，由于环境污染和过量采集等因素，导致天然海域的马尾藻资源日益枯竭。因此，为了恢复珊瑚礁生态系统的平衡，迫切需要进行马尾藻的人工移植和生态增养殖。

半叶马尾藻(Sargassum hemiphyllum)隶属于褐藻门(Phaeophyta)，墨角藻目(Fucaleso)马尾藻科(Sargassaceae)，马尾藻属(Sargassum)，主要生长在低潮线附近以及一米左右的岩石上，在低潮带较大的石沼中也有生长，是中国东海和南海沿岸常见种和优势种。该藻藻体较大，生长较快，是进行人工海藻场重建的优良物种，也是饲料、藻胶和饮料的优质提取原料。

种质资源是发展增养殖的物质基础，种质资源评价的数据对于在人工移植和生态增养殖过程中保持物种的遗传多样性具有重要意义，为资源养护和增养殖效果评价提供理论依据。由于微卫星(microsatellite，又称简单重复序列simple sequence repeats，SSRs)具有杂合程度高、多态性丰富、重复性好、共显性遗传等优点，已广泛应用于种群多样性的评估中。迄今为止，尚未开展马尾藻SSR标记的开发工作，本研究希望通过高度多态性SSR标记的开发为南海岛礁大型藻类遗传多样性研究、种群鉴定、资源养护和增养殖效果评价奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种半叶马尾藻SSR标记及其扩增引物、检测方法和应用，为半叶马尾藻遗传多样性分析及种群鉴定提供高度多态性的分子标记。

为实现上述发明目的，本发明对采自于湛江徐闻角尾海域和深圳杨梅坑附近海域的半叶马尾藻各三个样品进行基因组survey测序，将获得序列通过MISA(MIcroSAtelliteidentification tool)软件查找SSR位点，利用自编程序将具有地理差异的SSR位点筛选出来，共获得513个SSR位点。采用Primer Premier 5软件，随机针对筛选出的513个SSR位点中的260个位点进行引物设计。引物设计的要求为：引物长度18-22bp，GC含量为50-60％，Tm值为58-65℃，上下游引物的Tm值之差不大于5，并尽量避免引物二聚体、发夹结构及错配等；扩增产物长度为100-550bp。实验共设计和合成SSR引物260对，对半叶马尾藻基因组DNA进行PCR扩增，其中42对引物能稳定扩增出目的条带。采用筛选出的42对引物对来自于湛江徐闻角尾海域、湛江硇洲岛海域、深圳杨梅坑附近海域和万山群岛海域4个区域的半叶马尾藻DNA样品各4个进行扩增，采用3730XL测序仪对PCR扩增产物进行分型，并利用GeneMapper3.2软件读取等位基因片段的长度，用Cervus 3.0软件对多态性信息进行分析，最终确定了14个具有高度多态性的半叶马尾藻SSR标记。

本发明的第一个目的是提供一种半叶马尾藻的SSR标记，所述的SSR标记编号为S12、S16、S24、S31、S33、S39、S41、S53、S58、S72、S74、S85、S108和S143；