[发明专利]一种高活性FGF7蛋白的制备方法

说明书

本发明公开了一种高活性FGF7蛋白的制备方法。该制备方法包括以下步骤：1)构建pRSF‑SUMO‑rmFGF7重组质粒；2)将重组质粒转化至宿主菌，诱导表达，收集菌体；3)将菌体超声破碎、离心、收集上清液；4)将上清液经镍柱洗脱，收集洗脱液，得到初步纯化物；5)往初步纯化物中加入SUMO蛋白酶，进行透析酶切，将酶切物经镍柱洗脱，收集洗脱液，得到无标签FGF7蛋白；6)将无标签FGF7蛋白浓缩后，用分子筛Superdex 75柱洗脱，收集洗脱液，得到高活性FGF7蛋白。采用本发明方法通过2次镍柱纯化即可获得具有高生物活性、高纯度的rmFGF7蛋白，为FGF7蛋白的生产提供了新的途径。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种高活性FGF7蛋白的制备方法。

背景技术

成纤维细胞生长因子7(fibroblast growth factor,FGF7)又称角质生长因子KGF，是1989年由Rubin等人从人胚胎肺成纤维细胞中首先分离得到的一种细胞因子。特异性地与上皮细胞受体结合，引起细胞内一系列的信号传递，刺激上皮细胞的增殖、分化以及迁移，在上皮细胞的增殖与损伤修复中发挥独特的功能。小鼠和大鼠FGF7同源染色体研究表明，它涉及上皮形态功能的发生、伤口表皮细胞的再生、毛发的生长等。FGF7具有很多潜在应用，如在治疗糖尿病等代谢性疾病引起的慢性伤口愈合、早产儿支气管肺发育不良的应用、急性肺损伤、急性肝损伤的治疗等等均显示了较好的前景。FGF7存在多种突变体，蛋白结构和功能分析表明，肽链的前23个氨基酸的缺失并不降低FGF7的促有丝分裂活性。美国Amgen公司在大肠杆菌中表达N末端缺失23个氨基酸的KGF突变体palifermin(Kepivance^TM)，用于放化疗引起的口腔粘膜炎的治疗，2004年12月被美国FDA批准上市。

FGF7具有广泛的药理活性，但是由于FGF7蛋白在生产上存在产量低、不稳定、易聚集、成本高等问题，严重限制了其药物研发进程。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种高活性FGF7蛋白的制备方法。本发明方法利用改造的载体表达FGF7蛋白，SUMO标签提高了目的蛋白的表达量和可溶性，同时非常方便纯化。利用SUMO酶切除，经过后续简单纯化即可获得纯度高、活性好的FGF7蛋白，为FGF7蛋白的生产提供了新的途径。

本发明采取的技术方案如下：

一种高活性FGF7蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建pRSF-SUMO-rmFGF7重组质粒；

(2)将pRSF-SUMO-rmFGF7重组质粒转化至宿主菌，诱导表达，收集菌体；

(3)将菌体超声破碎、离心、收集上清液；

(4)将上清液经镍柱洗脱，收集洗脱液，得到初步纯化物；

(5)往初步纯化物中加入SUMO蛋白酶，进行透析酶切，将酶切物经镍柱洗脱，收集洗脱液，得到无标签FGF7蛋白；

(6)将无标签FGF7蛋白浓缩后，用分子筛Superdex 75柱洗脱，收集洗脱液，得到高活性FGF7蛋白。

优选的，步骤(1)中重组质粒的构建步骤为：将6×His-SUMO序列插入pRSFDuet-1载体的酶切位点Nco I、BamH I之间，得到pRSF-SUMO载体，所述6×His-SUMO序列如SEQ IDNO.1所示；将小鼠FGF7基因插入pRSF-SUMO载体的酶切位点BamH I和Xho I之间，得到pRSF-SUMO-rmFGF7重组质粒。

优选的，步骤(2)中所述的诱导表达是使用IPTG进行诱导。

优选的，步骤(4)中所述的洗脱是用含有100mM～200mM咪唑的缓冲液洗脱，所述的缓冲液组成为25mM Tris，300mM NaCl，溶剂为水，pH8.0。