[发明专利]一种用于检测HLA-A02基因的引物探针组、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测HLA‑A02基因的引物探针组、试剂盒及检测方法；其中，引物探针组包括核苷酸如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示的HLA‑A02特异性引物和HLA‑A02特异性探针；HLA‑A02基因的检测方法是采用试剂盒检测HLA‑A02，基于TaqMan®探针PCR技术来实现的，具有很高的特异性；同时，该方法通过合理的引物和探针搭配，有效避免引物与引物之间、引物与探针之间，以及探针与探针之间的相互作用，提高了HLA‑A02检测的特异性，有效避免了假阳性。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种用于检测HLA-A02基因的引物探针组、试剂盒及检测方法。

背景技术

癌症免疫疗法利用免疫系统来对抗癌症。尽管免疫疗法几十年来一直是癌症治疗的重要组成部分，但直到最近十年才引起关注，尤其在因发现细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白（CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白-1/程序性细胞死亡蛋白配体-1(PD-1/PD-L1)而被授予诺贝尔生理学和医学奖之后。如今免疫检查点抑制剂被用于治疗各种癌症，包括晚期非小细胞肺癌（NSCLC）、黑色素瘤和肾细胞癌的一线治疗。除了免疫检查点抑制剂，过继细胞疗法和肿瘤疫苗也是常见的癌症免疫疗法。这些癌症免疫疗法的基本机制是T细胞通过识别由肿瘤细胞膜上的主要组织相容性复合物(MHC)呈递的肿瘤抗原来发挥免疫功能。MHC是一组几乎在所有脊椎动物中都表达的多态性基因，它决定了不同个体之间的组织相容性。由于基因不同的小鼠之间的肿瘤排斥，MHC在20世纪的第一个十年中首次被发现。人类MHC也称为人类白细胞抗原(HLA)。HLAⅠ类分子在包括人类肿瘤细胞在内的大多数细胞类型上表达，将内源性抗原呈递给免疫系统。HLAⅡ类分子主要由抗原呈递细胞(APC)表达，将外源性抗原呈递给T辅助细胞。HLAⅠ类和Ⅱ类分子都表现出高度的多态性，这意味着它们在人群中具有许多不同的等位基因。这就是为什么供体和受体之间的HLA不匹配是移植排斥反应的主要原因。根据IMGT/HLA数据库，超过12,000个等位基因被鉴定为HLAⅠ类基因。在进化上，HLA分子的多样性确保了免疫系统能够识别尽可能多的抗原，并帮助我们防御各种病原体。有趣的是，在研究HLAⅠ类差异对免疫检查点抑制剂治疗癌症疗效的影响时，Chowell等人发现HLAⅠ类基因型的更大序列差异与自身、肿瘤和病毒免疫肽组的更高多样性有关。此外，与低HLAⅠ类差异的患者相比，具有高HLAⅠ类差异的患者对免疫检查点抑制剂的反应更好。这些发现表明，HLA多态性对我们对抗癌症至关重要。

CD8⁺ T细胞（通常称为细胞毒性 T 淋巴细胞或CTL）是针对肿瘤的适应性免疫系统的重要组成部分。大多数细胞毒性T细胞表达可以识别特定抗原的T细胞受体(TCR)。TCR与肿瘤细胞表达的肽-HLA复合物结合后，CTL被激活，在肿瘤部位聚集，释放效应子攻击肿瘤细胞。CTL通过两个主要途径对肿瘤细胞发挥特异性杀伤作用：（一）释放细胞毒物质如穿孔素、颗粒酶和细胞因子来杀死肿瘤细胞；(二)激活死亡受体通路，如T细胞表面表达的FasL，与肿瘤细胞表面的死亡受体Fas结合，启动凋亡相关信号，导致肿瘤细胞凋亡。最近在慢病毒等基因工程技术的帮助下，将识别肿瘤抗原的特异性TCR插入到大量T细胞的基因组中，这使得为每个人生产抗原特异性T细胞成为可能。因此TCR工程T细胞(TCR-T)被认为是一种更有希望的癌症患者治疗方法。TCR识别的肽-HLA复合物称为T细胞表位。已在临床试验中鉴定出数量非常有限的T细胞表位并用于免疫治疗，大多数已知肽受HLA-A02，HLA-A02等抗原限制，因此检测患者HLA-A02对提高癌症治疗效果有重要意义。