[发明专利]一种从裂壶藻废渣中提取外泌体的方法

说明书

本发明公开了一种从裂壶藻废渣中提取外泌体的方法。包括前处理：裂壶藻藻渣用弱碱水处理，再过滤收集滤液，滴加中和试剂至中性；和分离提取：依次通过四次离心，其中第二次离心的转速高于第一次离心；第三和第四次离心的转速均高于第二次离心。第四次离心所得沉淀即为外泌体；所述方法实现了变废为宝，克服了现有非动物来源的外泌体的提取技术不足和规模化生产外泌体的渠道缺乏的问题，同时制备得到的外泌体含量高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种从裂壶藻废渣中提取外泌体的方法。

背景技术

外泌体是一种细胞外囊泡，由细胞主动吞吐、分泌的具有膜结构的细胞外囊泡样小体。其直径约为30～300nm。1983年，Pan等发现羊未成熟红细胞可以分泌囊泡结构。1987年，Johnstone等将其命名外泌体(Exosomes)。随后科学家们发现多种细胞可以分泌外泌体。1996年，Stoorvogel等发现外泌体具有改变细胞外微环境、参与免疫调节以及影响机体健康等重要功能，外泌体才开始得到广泛关注。2013年，来自美国的科学家JamesE.Rothman、Randy W.Schekman和德国科学家Thomas C.Sudhof因揭秘外泌体等细胞内囊泡的运输调控机制而问鼎诺贝尔奖。

外泌体来源广泛，功能多样，几乎所有细胞都可分泌外泌体，而这些外泌体具有源细胞的种种特点。外泌体携带了很多核酸、蛋白、脂类等物质，可以改变细胞的信息传递和生理状态，目前外泌体在疾病诊疗方面的研究取得了多项成果，展示了外泌体参与机体免疫应答、细胞迁移、细胞增殖分化、细胞凋亡、肿瘤侵袭等过程。近年来，外泌体作为一种免疫原性低、生物相容性高、给药效率高的药物载体而出现。KIM等开发并优化了一种含有氨基乙基乙醇胺-聚乙二醇(AA-PEG)载体修饰装载有抗癌药物紫杉醇(PTX)的外泌体，该外泌体对PTX具有较高的承载能力，系统给药后在癌细胞中积累能力强，治疗效果明显改善，为抗癌治疗提供了一个强大而新颖的载体。

目前大部分关于外泌体的研究成果多集中于动物细胞来源的外泌体。然而其提取工艺复杂，成本高，收率低；如果把动物细胞来源的外泌体作为药物载体，含有与供体细胞一致的脂质、核酸及蛋白等，应用过程存在安全性问题。而植物来源的外泌体，作为药物载体其安全性更为可靠。研究发现选择特异性外泌体作为药物载体搭载姜黄素，可增加血药浓度、药物稳定性，并且降低脱靶效应，提高了药物的疗效，且无明显的副作用，同时此方法克服了姜黄素水溶性差、利用度低、药效发挥有限的缺点。吴菊萍等从番茄中制备的外泌体作为载体负载模型药物也获得成功。另外，植物外泌体含有较为丰富的miRNA，其为一类内源单链非编码RNA，在生物体中起着重要的作用，是一种高效的基因表达调控因子。许多研究证实来自植物外泌体的miRNA作为新的生物活性成分可与哺乳动物系统相互作用，实现跨界调控，具有广阔的应用前景。

二十二碳六烯酸(DHA)是一种长链不饱和脂肪酸，是人体大脑皮层、视网膜的重要组成物质，对促进人体的健康具有重要的意义，同时DHA还可以预防代谢紊乱，提高免疫功能和生殖健康，有效抑制血栓的形成，预防心血管疾病的发生，被广泛用于食品、药品等。以前，人们获取DHA产品的主要来源是脂肪含量高的鱼类。但随着我国海洋渔业的退化，以及水体环境污染威胁，传统来源的DHA产品面临着渔获量少、水体污染导致的质量差、及鱼腥味造成口感差等问题影响。

裂壶藻又称裂殖壶菌，隶属真菌门、网粘菌纲、破囊壶菌目、破囊壶菌科，呈球形单细胞，其直径为7～15μm。裂壶藻是一种高DHA含量的海洋藻类，已成为当前DHA工业化生产的主要藻种，利用裂壶藻生产的DHA藻油已被我国卫生部批准成为新资源食品原料。而提取藻油后的大量废渣的再利用值得探索。

裂壶藻经提取不饱和脂肪酸后所产生的藻渣，目前这些藻渣大多被当成饲料或肥料处理，藻渣资源未得到充分开发与高值利用。本文以工业化提取油脂后的裂壶藻渣为原料，提取新型的、药用活性成分外泌体。目前植物来源的外泌体市售价格在1mg几十到几百。本专利提供一种制备裂壶藻外泌体的较优工艺，以期为藻渣废料的高值化利用提供新的渠道和方法。