[发明专利]微滴式数字PCR检测鸡细小病毒的引物组、探针及应用

说明书

本发明提供微滴式数字PCR检测鸡细小病毒的引物组、探针及应用，属于鸡细小病毒检测技术领域，物组由上游引物ChPV‑F和下游引物ChPV‑R和探针ChPV‑P。检测过程为参考GenBank中ChPV的NS基因保守序列，设计筛选了特异性探针和引物，通过对反应条件的优化，评估特异性、敏感性和重复性试验。本发明对其他常见鸡病病原体进行检测，没有特异性扩增，结果均为阴性，批内重复性和批间重复性较好，而对常见的鸡病包括ANV、CIAV、AIV‑H9、NDV、AGV2和IBV等进行检测，均没有出现特异性目的条带。且灵敏度4.5个拷贝/反应，高出荧光定量PCR和普通PCR10和1000倍，具有超高的敏感性。

技术领域

本发明涉及鸡细小病毒检测技术领域，尤其涉及微滴式数字PCR检测鸡细小病毒的引物组、探针及应用。

背景技术

鸡细小病毒(Chincken parvovirus，ChPV)是引起鸡肠道疾病的最重要病原体之一，可导致鸡群出现急性或慢性肠道性疾病：如矮小综合症，营养不良综合症，其临床表现为腹泻、精神沉郁、体温失调、生长迟缓、饲料消耗增加等。ChPV对各种品种鸡群均易感，病毒主要侵害雏鸡，使其发病甚至死亡，随着日龄的增长，成年鸡对ChPV会产生耐受性，临床上表现为无症状甚至体内转为ChPV阴性。从2010年开始，北美、波兰、巴西、匈牙利、克罗地亚和韩国等国家均报道了此病，给当地的养鸡业造成较大损失。

目前，针对ChPV的检测方法很多，其中，鸡胚病毒分离与鉴定是确诊该病的“金标准”，但病毒分离培养操作繁琐，所需要的时间较长，影响其有效分离到病毒的因素较多；PCR和荧光定量PCR方法较为常用，但其灵敏度仍有待提高，特别是在病毒含量极低时常会出现假阴性或可疑结果的情况，所以有必要建立一种灵敏度更高、更准确的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供微滴式数字PCR检测鸡细小病毒的引物组、探针及应用，解决背景技术中提到的技术问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

微滴式数字PCR检测鸡细小病毒的引物组和探针，所述引物组和探针的核苷酸序列如下所示：

上游引物ChPV-F：5’GAGGAACCCCCCTATACTGGTT 3’(SEQ ID NO： 1)；

下游引物ChPV-R：5’TCATTCTTACCTTCGTTGGCTTT 3’(SEQ IDNO： 2)；

探针ChPV-P：5’FAM-TGAATCCGGGCTCTT-BHQ13’(SEQ ID NO：3)。

进一步地，所述上游引物ChPV-F、下游引物ChPV-R和探针ChPV-P 的摩尔比为3:3:2。

微滴式数字PCR检测鸡细小病毒的引物组和探针在PCR扩增中的应用，退火温度为54.0℃。

微滴式数字PCR检测鸡细小病毒的引物组和探针在PCR扩增中的应用，总的扩增体系为20μL：dd PCRTMSupermix for Probe 10μL，设置6个不同引物探针组合，浓度均为600、600、900、900、1200、1200nmol/L上下游引物各1μL，对应浓度梯度为200、300、400、600、700、800nmol/L的探针1μL，最后用ddH₂O补足20μL反应体系。

进一步地，在PCR扩增中，dd PCR反应程序为：95℃预变性10min； 94℃30s，退火温度60.0～50.0℃，40个循环，98℃固化10min，4℃结束反应，升降温度设置2.0℃/s。