[发明专利]一种IRES序列介导的非帽依赖型的基因表达载体及其应用

说明书

本发明公开了一种IRES序列介导的非帽依赖型的基因表达载体及其应用，具体的，所述应用为体外转录RNA的翻译表达。本发明提供了DNA分子甲，自上游至下游依次包括如下元件：5’UTR、供目的基因插入的位点和3’UTR。本发明还保护具有所述DNA分子甲的重组载体甲。本发明还提供了DNA分子乙，自上游至下游依次包括如下元件：5’UTR、目的基因和3’UTR。本发明还保护具有所述DNA分子乙的重组载体乙。5’UTR如序列表的序列1中第442‑1183位所示。本发明提供了重组载体可用于体外转录mRNA，尤其适用于mRNA疫苗或mRNA药物的制备。本发明对于mRNA疫苗或mRNA药物生产具有重大的应用推广价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种IRES序列介导的非帽依赖型的基因表达载体及其应用，具体的，所述应用为体外转录RNA的翻译表达。

背景技术

20世纪60年代mRNA首次被科研人员发现，随着mRNA合成、修饰技术和递送技术的发展，现在mRNA作为药物已逐渐被应用到疫苗及疾病治疗等多种领域。简单来讲，mRNA药物是指经过体外转录合成及修饰的mRNA，被递送至细胞或体内，进而表达病毒抗原以激活机体的免疫能力，或产生机体所需要的目的蛋白，达到传染病预防、肿瘤治疗等目的。

相比传统手段，mRNA具有生产方便、半衰期短、无整合风险、安全性高等优势。mRNA不需要入核，进入细胞质即启动蛋白质翻译过程。mRNA不需要整合到基因组，只是瞬时表达编码蛋白，因此不存在插入突变的风险。而且，mRNA在细胞内是暂时性的活跃，可以通过生理途径完全代谢，没有持续积累毒性的风险。此外，mRNA的快速、简易制备方法和低成本也是其成为非常有潜力的候选药物的优势之一。

mRNA的稳定翻译需要5’的帽子结构。真核生物mRNA由7-甲基鸟嘌呤三磷酸核苷(m7GpppN)组成帽子结构。mRNA的加帽过程是mRNA生产中举足轻重的步骤之一。在常规mRNA体外转录制备方案中，常用的加帽方法主要有两种，一种是使用牛痘病毒加帽酶进行转录后加帽，但该方法制备和纯化步骤繁琐，成本较高。另一种是使用抗反转帽结构类似物(ARCA,Anti-reverse cap analogues)进行共转录加帽，该方法加帽效率较低，无法完全满足目前mRNA制备及生产的实际需求。近期，科学家开发了CleanCap加帽技术，加帽效率可达90％，但仍然需要考虑成本。因此，开发更优的mRNA体外转录替代方案，对于mRNA药物的研发及应用前景具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种IRES序列介导的非帽依赖型的基因表达载体及其应用，具体的，所述应用为体外转录RNA的翻译表达。

本发明提供了一种DNA分子(DNA分子甲)，自上游至下游依次包括如下元件：5’UTR、供目的基因插入的位点和3’UTR；所述5’UTR如序列表的序列1中第442-1183位所示。该5’UTR即EV71-IRES(EV71病毒的IRES)。

所述3’UTR为人β-globin的3’UTR。

所述3’UTR为两个连续的人β-globin的3’UTR。

所述3’UTR如序列表的序列1中第2857-3070位所示。

所述DNA分子中还包括启动子和polyA，所述启动子位于5’UTR的上游，所述polyA位于3’UTR的下游。

所述启动子为T7启动子。

所述启动子如序列表的序列1中第422-441位所示。

所述polyA如序列表的序列1中第3077-3196位所示。

所述DNA分子中还包括Kozak序列。

所述Kozak序列位于5’UTR的下游且位于供目的基因插入的位点的上游。