[发明专利]一种用于检测活细胞中mTORC1活性的遗传编码荧光生物传感器及其构建方法

说明书

本发明公开了一种用于检测活细胞中mTORC1活性的遗传编码荧光生物传感器及其构建方法，其包括：融合体基因结构A、融合体基因结构B、用于连接融合体基因结构A和融合体基因结构B的连接部。融合体基因结构A是由mTORC1磷酸化底物的编码基因、标记蛋白基因和寡聚化标签基因组成的融合基因；融合体基因结构B是由所述mTORC1磷酸化底物的结合蛋白编码基因和寡聚化标签基因组成的融合基因；连接部为自剪切多肽的编码基因。该传感器可对抑制态mTORC1进行快速有效地活细胞检测，并可广泛用于mTORC1活性抑制剂及调控基因的筛选。

技术领域

本发明属于生物传感器领域，具体涉及一种用于检测活细胞中mTORC1活性的遗传编码荧光生物传感器及其构建方法。

背景技术

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是真核生物中一种关键的代谢调节激酶，具有丝氨酸和苏氨酸激酶活性(Ser/Thr kinase)。mTOR通过整合营养物质、生长因子和能量代谢等细胞内外信号参与基因转录、蛋白质翻译和核糖体合成等多种生物学功能调控，从而进一步调节细胞的代谢生长、凋亡和自噬等核心生理过程，因此，也被称为细胞的“大脑”。mTOR及其介导的信号通路紊乱与人类代谢、寿命、癌症及癫痫等重大疾病的形成和发展密切相关。

介导mTOR生物学效应的分子分两种：一种是哺乳动物雷帕霉素靶标蛋白复合物1(The mammalian Target of Rapamycin complex 1，mTORC1)，另一种是哺乳动物雷帕霉素靶标蛋白复合物2(mTORC2)。关于mTORC1信号的生理病理研究相对广泛，mTORC1复合物包含激酶mTOR和调控蛋白RICTOR及支架蛋白mLST8等功能，因此，mTORC1活性的变化是相关疾病生理病理变化的重要判断依据。

相关技术中，大多数mTORC1检测技术主要是利用特异性抗体通过蛋白印迹和免疫组织化学手段检测体外提取蛋白或固定组织细胞中mTORC1底物磷酸化水平(如磷酸化S6K或磷酸化4EBP1)来判断mTORC1的活性，但普遍存在检测耗时长、无法实现高通量快速检测、检测成本高、受制于抗体特异性或对于检测人员的操作要求高等问题。

因此，开发一种能够克服上述缺点，并可以实现在活细胞中通过荧光显微镜快速、有效、实时检测mTORC1活性的检测方法及生物传感器，对于细胞水平上的高通量mTORC1抑制药物或调控物的筛选和鉴定具有极为重要的意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于检测活细胞中mTORC1活性的遗传编码荧光生物传感器及其构建方法，该传感器可以作为检测活细胞mTORC1活性的传感器，其在mTORC1失活条件下从弥散态形成聚集点是其响应mTORC1活性的显著特征，从而可进一步用于mTORC1抑制剂的筛选以及mTORC1活性调控基因的筛查。

本发明的第一个方面，提供一种生物传感器，该生物传感器包括：

融合体基因结构A、融合体基因结构B、用于连接融合体基因结构A和融合体基因结构B的连接部；

所述融合体基因结构A是由mTORC1磷酸化底物的编码基因、标记蛋白基因和寡聚化标签基因组成的融合基因；

所述融合体基因结构B是由所述mTORC1磷酸化底物的结合蛋白编码基因和寡聚化标签基因组成的融合基因；

所述连接部为自剪切多肽的编码基因。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述mTORC1磷酸化底物为4EBP1。

4EBP1(真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1)是mTOR的下游分子之一，主要其调控蛋白质的翻译功能。Gene ID：1978(人源)或13685(鼠源)。