[发明专利]一种产人源透明质酸酶PH20的重组毕赤酵母及其构建方法

说明书

本发明公开了一种产人源透明质酸酶PH20的重组毕赤酵母及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明通过对hPH20的C端结构域优化，结合N端蛋白标签融合策略，构建了一个hPH20突变体AP₂‑△491C；利用整合型质粒pPIC9K和强启动子P_AOX1实现了hPH20突变体在P.pastoris GS115中的诱导表达，经3‑L发酵罐培养，发酵液中酶活达到258.1U/L，是目前微生物表达系统发酵制备hPH20的最高水平。该突变体能够水解机体组织中的大分子HA，增加组织细胞膜渗透性，在促进药物扩散吸收、增强药效、降低眼压等临床医学方面具有应用价值。

技术领域

本发明涉及一种产人源透明质酸酶PH20的重组毕赤酵母及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

透明质酸酶(Hyaluronidases，Hyals)是使透明质酸(HA)产生低分子化作用的一类酶的总称。由于具有促药物吸收、抗肿瘤信号传导和降低眼压功能，Hyals在医学上被广泛应用。依据其催化机制和产物不同，Hyals分为三类：第一类为内切β-N-乙酰氨基葡萄糖甘酶(EC 3.2.1.35)，主要存在于哺乳动物、蜜蜂、蛇毒、蜂毒以及溶菌体等毒液中，属于hyaluronate 4-glycanohydrolases家族，作用于HA的β-1,4糖苷键生成四糖(HA4)为主要水解产物，同时也能水解软骨素类多糖且具有转糖苷作用；第二类为内切β-葡萄糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.36)，主要存在于水蛭、钩虫及唾液腺，属于hyaluronate 3-glycanohydrolases家族，作用于HA的β-1,3糖苷键生成的水解终产物为HA4和HA6且还原端为GlcUA，其中水蛭透明质酸酶具有高度的底物专一性且无转糖苷作用；第三类为透明质酸裂解酶(EC 4.2.2.1)，主要存在于微生物中如链球菌、梭菌，以β-消除裂解方式作用于HA的β-1,4糖苷键，产生不饱和葡糖醛酸-N-乙酰己糖胺。

目前已表征的Hyals大多来源于动植物昆虫毒液(如Hippasa partica、Palamneusgravimanus、Bee hyaluronidase)、动物组织(如Hirudo medicinalis、Bovin testicularhyaluronidases)以及微生物(如Streptococcus agalactiae、Propionibacteriumacnes)，这些Hyals在实际应用中对人体组织和器官均存在一定免疫原性风险，易被当作外来抗原，从而诱发机体免疫识别机制。

hPH20能够水解细胞间基质、改善组织周围体液流动性且不被人体巨噬细胞识别而清除，在临床医学中具有重要应用价值。目前，hPH20已在昆虫、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等宿主中重组表达，但这些宿主存在培养周期长、遗传操作复杂、重组表达hPH20产量低的问题，限制了hPH20的进一步应用。毕赤酵母(P.pastoris GS115)具有生长速度快、遗传操作简单、分泌效率高、对外源蛋白进行糖基化修饰的优点，是实现重组酶高水平分泌表达的常用真核表达系统。2016年，有研究者利用质粒pGAPZαC和启动子P_GAP实现了hPH20在P.pastoris GS115中的组成型表达，然而hPH20在发酵液中的产量仅为2U/L，远不能满足应用需求。

发明内容

本发明提供了一种透明质酸酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3任一所示。

在一种实施方式中，所述透明质酸酶突变体为hPH20△484C，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述透明质酸酶突变体为hPH20△491C，其氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述突变体的C端还融合有6×His标签。

在一种实施方式中，所述透明质酸酶突变体在N端或C端还连接了蛋白标签AP₂、HL₂₈或Sumo。