[发明专利]一种噬菌体alpha3裂解蛋白E及其应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种噬菌体alpha3裂解蛋白E及其应用，所述裂解蛋白E与噬菌体phiX174的裂解蛋白一样拥有一个保守的跨膜区，能有效抑制大肠杆菌的生长，该裂解蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，编码该裂解蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过将噬菌体alpha3的裂解蛋白E的基因克隆到表达载体上，进而得到可高效表达裂解基因E的重组大肠杆菌。实验证明，所述裂解蛋白E可以有效在大肠杆菌表面形成孔道，起始诱导OD高，裂解持续时间长，裂解效率可达99.99％，为进一步大规模制备大肠杆菌菌影提供基础。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种大肠杆菌噬菌体裂解蛋白应用。

背景技术

单链DNA噬菌体phiX174等小噬菌体只编码跨膜孔形成蛋白(即穿孔素蛋白)单一裂解基因，这类噬菌体并不导致宿主细胞完全裂解，而是引起细胞膜出现孔道造成细胞内容物流失，形成细胞壁几乎完好无损的细菌空壳——即菌影。菌影内部虽然没有细胞成分，但其保留了天然活菌原有的细胞形态，包括菌毛、纤毛、脂多糖、肽聚糖和脂质A等天然免疫刺激复合物，是最接近活细菌形态的一类细菌衍生物递送系统。也因为菌影与吞噬细胞、树突状细胞等抗原递呈细胞具有良好的结合能力，能够被抗原递呈细胞有效利用，尤其是通过口服、滴鼻、点眼等途径进行免疫，可诱导强烈的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫应答，常被开发用于佐剂、疫苗等领域。此外，菌影的空腔结构还可以接收大量外源物质，包括亲疏水性药物，蛋白质抗原、核酸等，作为递送载体，菌影对提高物质的稳定性和溶解度，减少药物的剂量和毒副作用具有极大的意义。

目前普遍认为菌影是通过调控噬菌体phiX174裂解基因E的表达而形成的，该基因编码的裂解蛋白由91个氨基酸残基组成，通过裂解蛋白E在细胞内膜聚集和构象改变从而促进细胞内外膜融合，裂解的孔道一般大小为40～200nm。跨膜孔道的形成过程一般有以下几个阶段：阶段一表达裂解蛋白E并整合到细菌细胞内膜，此时其C末端面向细胞质；阶段二裂解蛋白E的第21位脯氨酸残基发生顺反异构使得裂解蛋白E整合到外膜，并形成寡聚体，此时裂解蛋白的C末端穿出内膜，在周质腔中；阶段三细菌细胞内外膜进行融合，膜电位崩溃，并形成跨膜孔道，此时裂解蛋白的C端穿出外膜。

传统的使用噬菌体phiX174裂解蛋白制备菌影有许多不足之处，如细菌裂解的发生与细菌的生长时期有关，通常细菌裂解起始OD值被限制在0.2-0.6，因而产率较低且裂解持续时间短，易出现抗裂解突变株，为了解决这些关键的问题，常需要串联表达金黄色葡萄球菌核酸酶A，但起始诱导OD也仅提高至为1.2，若使用双质粒表达系统则需考虑质粒的兼容性及质粒在菌株中的稳定性，这也成为制约了菌影推广应用的因素之一，因此有必要为高效制备大肠杆菌菌影探索新的方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种源自噬菌体alpha3的裂解蛋白，其与噬菌体phiX174的裂解蛋白一样拥有一个保守的跨膜区，能有效抑制大肠杆菌的生长，该裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码该裂解蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的目的之二在于所述源自噬菌体alpha3裂解蛋白可用于高效制备大肠杆菌菌影。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种噬菌体alpha3裂解蛋白E，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

编码上述噬菌体alpha3裂解蛋白E的基因，其核苷酸序列如SEQID No：1所示。

所述噬菌体alpha3裂解蛋白E在高效制备大肠杆菌菌影的应用，包括以下步骤：

(1)将所述噬菌体alpha3裂解蛋白E的基因与载体连接，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌，获得重组大肠杆菌；