[发明专利]一种基于嗜热四膜虫tubulin蛋白的刺激隐核虫疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种基于嗜热四膜虫tubulin蛋白的刺激隐核虫疫苗的制备方法，其包括如下步骤：

一、交叉抗原的鉴定

(一)、刺激隐核虫传代

将卵形鲳鲹暂养于1000L的海水池中，每天分别于上午8点和下午5点投喂商品饲料；晚上加入孵出时间在2h内的刺激隐核虫幼虫感染卵形鲳鲹，刺激隐核虫感染浓度为20000幼虫/尾鱼，感染时将水位控制在40L/尾鱼，静水暂养，感染2h后将卵形鲳鲹转移到新的海水池中流水暂养；感染2d后，即可观察到卵形鲳鲹体表及鳃上有大量的白点，然后将卵形鲳鲹转移到特定的刺激隐核虫收虫器；次日早上，收集固着在收虫器杯底的刺激隐核虫包囊，将包囊放入灭菌海水于28℃孵育，2d后即有大量幼虫孵出，显微计数孵化2h内的幼虫浓度，进行下一批的传代感染。

(二)、抗血清的制备

为制备嗜热四膜虫免疫石斑鱼血清，首先用含青霉素、链霉素和两性霉素B的PYY培养液复苏实验室保存的嗜热四膜虫，30℃静置培养2-3天后将嗜热四膜虫转移至NEFF培养液中进行培养，然后依次用含1倍10μM巴龙霉素、3倍10μM巴龙霉素、5倍10μM巴龙霉素、7倍10μM巴龙霉素的NEFF培养液进行选择培养；筛选后转移至大体积NEFF培养液中扩大培养，收集嗜热四膜虫并用PBS溶液洗涤3次，最后用PBS溶液重悬，并计数嗜热四膜虫数量；

将PBS溶液重悬的嗜热四膜虫与等体积的弗氏完全佐剂混合后进行乳化，注射免疫10尾石斑鱼，每尾鱼注射10000嗜热四膜虫；初次免疫14天后，将嗜热四膜虫和等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，对首次免疫的10尾石斑鱼进行加强免疫，每尾鱼注射10000嗜热四膜虫；初次免疫42天后，以每尾鱼4000刺激隐核虫幼虫的剂量对石斑鱼进行攻毒，于攻毒后第3天采集石斑鱼的血清。

(三)、交叉抗原鉴定

提取刺激隐核虫总蛋白，与上一步骤采集的石斑鱼血清混合，置于摇床上4℃孵育过夜；向刺激隐核虫总蛋白与石斑鱼血清混合溶液中加入结合了抗石斑鱼IgM抗体的亲和纯化柱，于摇床上4℃孵育过夜；离心后去除上清，保留沉淀；用PBS溶液洗涤沉淀后，将沉淀产物进行质谱分析，鉴定与抗石斑鱼IgM抗体结合的刺激隐核虫蛋白；

对质谱结果分析：发现在所有鉴定到的刺激隐核虫蛋白中，tubulin蛋白得分最高，说明嗜热四膜虫tubulin是引起石斑鱼血清与刺激隐核虫蛋白产生交叉反应的主要抗原，因此，嗜热四膜虫tubulin蛋白可作为潜在的交叉抗原制备疫苗。

二、重组蛋白的表达纯化

(一)、重组tubulin蛋白表达载体构建

(1)pMD18T-Tt-tubulin质粒的提取

为适应大肠杆菌表达系统，将嗜热四膜虫tubulin蛋白的基因序列进行密码子优化；合成密码子优化后的嗜热四膜虫tubulin基因序列，并将tubulin基因克隆至pMD18T载体中，获得pMD18T-Tt-tubulin质粒，再把pMD18T-Tt-tubulin质粒转化到大肠杆菌DH5α中；

按以下步骤提取pMD18T-Tt-tubulin质粒：

a、将带有pMD18T-Tt-tubulin质粒的大肠杆菌DH5α接种到LB平板上进行复苏，挑取单菌落至5 mL含有20μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，于37℃、180rpm振荡培养过夜；

b、10,000×g离心菌液1min，弃上清，保留沉淀细菌；

c、向沉淀中加入250μL含有RNAase的Solution I进行重悬；

d、向重悬液中加入250μL Solution II，上下颠倒5次，室温静置2min；

e、再加入350μL Solution III，上下颠倒10次，13,000×g离心10min；

f、将回收柱装在2mL收集管上；

g、吸取步骤e中的离心上清至回收柱，10,000×g离心1min，弃滤液；

h、向回收柱中加入650μL无水乙醇稀释的Wash buffer，10,000×g离心1min，弃滤液；

i、重复h步骤1次；

j、13,000×g离心2min甩干回收柱；

k、丢弃收集管，将回收柱装在新的EP管上，再向回收柱中加入30μL水溶解2min，13,000×g离心1min，质粒即位于洗脱液中；

l、取少量洗脱液，测定其中质粒的浓度，其余样品备用。

(2)pET32a-ΔTRX质粒的提取

采用与提取pMD18T-Tt-tubulin质粒相同的方法，提取pET32a-ΔTRX质粒；

(3)酶切和连接转化

对提取的pMD18T-Tt-tubulin质粒和pET32a-ΔTRX质粒分别进行酶切，酶切体系为：2μLpMD18T-Tt-tubulin质粒或pET32a-ΔTRX质粒、10μL 10×QuickCut Buffer、2μL EcoR I、2μL Kpn I和84μL水；将酶切溶液混匀后，于37℃反应30min；酶切溶液进行电泳后，分别回收tubulin基因和pET32a-ΔTRX载体；

使用T4连接酶将酶切后回收的tubulin基因和pET32a-ΔTRX载体进行连接，连接体系为：3μL pET32a-ΔTRX、2μL tubulin和5μL T4连接酶；将连接体系混匀后，16℃连接过夜，再置于冰上冷却；将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆菌，其中即含有pET32a-ΔTRX-Tt-tubulin质粒。

(二)、重组tubulin蛋白表达菌的筛选

采用与提取pMD18T-Tt-tubulin质粒相同的方法，提取阳性克隆菌的pET32a-ΔTRX-Tt-tubulin质粒，再转入大肠杆菌BL21中；挑取含有pET32a-ΔTRX-Tt-tubulin质粒的大肠杆菌BL21，接种于5mL含有20μg/mL氨苄青霉素LB培养液中，37℃、180rpm振荡培养；当菌液OD600达到0.6时，将菌液分成2份：一份作为诱导组，向其中加入IPTG至终浓度为1mM；另一份作为对照组，不加任何试剂；两份菌液继续培养2h后，10,000×g离心菌液1min，弃上清，保留细菌沉淀；在沉淀中加入80μL水重悬细菌，再加入20μL 5×蛋白上样缓冲液，100℃水煮10min；将两份处理后的细菌样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后取下胶块，使用考马斯亮蓝染色液进行染色，再使用脱色液进行脱色。

(三)、重组tubulin蛋白的纯化

挑取上一步骤筛选的可以表达tubulin重组蛋白的细菌，接种到5mL LB培养液中过夜培养，再将5mL菌液转接到500mL LB培养液中，37℃振荡培养4h后，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养2h；8,000×g离心菌液10min，弃上清，保留细菌沉淀；向细菌沉淀中加入50mL含50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl和10mM Imidazole的Lyse buffer重悬细菌，将重悬的菌液于冰上超声破碎，破碎条件为：250W、10s超声、10s间隔，共超声30min；8,000×g离心超声破碎的细菌10min，弃上清，保留沉淀；使用含100mM NaH₂PO₄和10mM Tris-HCl的2M、4M、6M尿素溶液依次洗涤沉淀，最后将沉淀溶解在8M尿素中；嗜热四膜虫tubulin重组蛋白组要溶解在8M尿素里，再使用镍柱从尿素溶液中纯化tubulin重组蛋白，步骤如下：

a、将镍填料装入亲和层析管中，再加入10倍填料体积的平衡溶液过柱；

b、关闭柱子底部的开关，加入含重组tubulin蛋白的8M尿素溶液，4℃过夜；

c、打开柱子底部的开关，收集流出液；

d、加入10倍填料体积的Wash buffer过柱，收集流出液；

e、重复d步骤一次；

f、加入5倍填料体积Elution buffer过柱，收集洗脱液，从而获得纯化的重组tubulin蛋白液；

取部分步骤f收集的洗脱液，进行SDS-PAGE凝胶电泳。如图1第3泳道所示，经镍柱亲和纯化后，得到单一重组tubulin蛋白条带。

三、重组蛋白对石斑鱼的免疫保护测试

(一)、免疫

将石斑鱼暂于1000L的海水池中，每天分别于上午8点和下午5点投喂商品饲料；将石斑鱼分为实验组和对照组；将纯化后的重组tubulin蛋白液与等体积的弗氏完全佐剂乳化制成疫苗，通过皮肤下注射对实验组石斑鱼进行首次免疫；首次免疫两周后，将纯化后的重组tubulin蛋白液与等体积的弗氏不完全佐剂乳化制成疫苗，对首次免疫的石斑鱼进行加强免疫；对照组分别注射PBS与等体积弗氏完全佐剂、等体积弗氏不完全佐剂的乳化物。

(二)、刺激隐核虫攻毒

将对照组和免疫组的石斑鱼分别转移到装有10L海水的箱子中，每箱放置1尾鱼，静水暂养，往每个箱子中加入4,000刺激隐核虫幼虫感染石斑鱼2h，然后将石斑鱼捞出并转移到玻璃缸中流水暂养；刺激隐核虫感染2d后，将石斑鱼再次分装于各个箱子中，每箱1尾鱼，静水暂养，于2d后收集箱底的包囊；在解剖镜下计数从每尾石斑鱼脱落的包囊数量，收集的包囊数量与感染幼虫剂量的比值即为感染率；

结果表明：首次免疫六周后，相对于未免疫的对照组，重组tubulin蛋白免疫石斑鱼组的感染率显著降低。

四、抗刺激隐核虫疫苗的制备

将纯化后的重组tubulin蛋白液，再分别与等体积的弗氏完全佐剂和等体积的弗氏不完全佐剂混合，于冰上使用匀浆机进行乳化，制成首次免疫疫苗和加强免疫疫苗，于4℃保存。