[发明专利]猪源性抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达单链抗体及其制备和应用

说明书

本发明涉及猪源性抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达单链抗体及其制备和应用。本发明的真核表达单链抗体至少具有由如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的猪抗体重链可变区VH和如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的猪抗体轻链可变区VL以及由中间连接肽Linker构成的猪源单链抗体片段VH‑Linker‑VL。将该片段的编码基因插入真核表达质粒pCMV‑HA，构建成为重组真核表达质粒pCMV‑HA‑ZW1‑7。将pCMV‑HA‑ZW1‑7转染IPEC‑J2细胞，该单链抗体在IPEC‑J2细胞中成功表达，分子量大小约为28kDa；该单链抗体在感染猪流行性腹泻病毒48h和72h后，均能够显著降低猪流行性腹泻病毒的滴度(P0.05)；具有一定的抵抗猪流行性腹泻病毒感染的作用。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及猪源性抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达单链抗体及其制备和应用。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)感染猪引起的猪的临床表现为腹泻、呕吐、食欲不振甚至导致猪死亡的一种传染性肠道疾病。不同年龄的猪感染PEDV以后，临床表现严重程度不同，感染后的7日龄以内的新生仔猪的死亡率高达100％。PED在全球多个国家均有爆发，给全世界养猪产业造成严重的经济损失。疫苗接种通常被认为是一种预防病毒性疾病的有效方法，但是由于PEDV的变异速度快，商业化疫苗在临床中的预防效果并不理想。直接给机体输入特异靶向致病原或致病原组成蛋白的抗体的被动免疫是一种有效方法。N蛋白是PEDV的结构蛋白之一，它除了参与病毒粒子的构成，还能够调控病毒的复制和翻译等，受到越来越多的关注。

单链抗体是基因工程抗体中的一种，通过一段柔性短肽Linker将抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL连接而成，分子量小，免疫原性低，组织渗透性好，在疾病的检测和治疗中，显示了巨大的应用潜力，已有越来越多的单链抗体被应用到临床中。

发明内容

本发明提供一种猪源性抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达单链抗体及其制备和应用。

本发明提供的真核表达单链抗体能够与猪流行性腹泻病毒N蛋白特异性结合，可降低猪流行性腹泻病毒在猪小肠上皮细胞(intestinal porcine epithelial cell lineJ2，IPEC-J2)内的滴度，能够用于抑制猪流行性腹泻感染的研究。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明首先提供一种猪源性抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达单链抗体，其具有如SEQ ID No.1所示的猪源抗体的重链可变区VH的氨基酸序列、如SEQ ID No.2所示的猪源抗体的轻链可变区VL的氨基酸序列和中间连接肽Linker的氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS，组成顺序为VH-Linker-VL的猪源单链抗体片段。

在本发明的一个实施方式中，猪源性抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达单链抗体，记为ZW1-7，具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

本发明还提供一种猪源性抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达单链抗体的编码基因，具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

在本发明的一个实施方式中，编码基因的核苷酸序列中进一步包含限制性内切酶位点XhoI和NotI，其中酶切位点XhoI的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，酶切位点NotI的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明还提供一种含有猪源性抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达单链抗体的载体。

在本发明的一个实施方式中，所述载体为真核表达质粒。

在本发明的一个实施方式中，所述载体为pCMV-HA-ZW1-7真核表达质粒。