[发明专利]一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的巢式PCR方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的巢式PCR方法及试剂盒。本发明采用牛的艾美耳球虫SSU rRNA基因作为检测靶序列，所述序列中具有保守区域和可变区域，相应扩增片段中包含多个单核苷多态性位点；本发明进一步通过设计巢式PCR引物，建立了牛中常见艾美耳球虫巢式PCR检测方法，可检测出不同的牛中常见艾美耳球虫，进行艾美耳球虫的虫种鉴定。采用本发明的检测方法能够最低检测到一个卵囊，其扩增效率高，检测灵敏，可以准确区分牛感染的不同艾美耳球虫，并确定引起发病的不同虫种，用于牛球虫病的精准防控。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的巢式PCR方法及试剂盒。

背景技术

艾美耳球虫(Eimeria)是牛科动物中常见的肠道寄生虫，主要引起以急性肠炎和血便为主的牛球虫病，在2岁以内的犊牛感染率可高达到100％，而且具有高致死率，因此对畜牧业危害严重。目前，在我国牛中已发现的艾美耳球虫有13种，分别是椭圆艾美耳球虫(E.ellipsoidalis)、亚球形艾美耳球虫(E.subsperica)、邱氏艾美耳球虫(E.zuernii)、阿拉巴马艾美耳球虫(E.alabamensis)、牛艾美耳球虫(E.bovis)、加拿大艾美耳球虫(E.canadensis)、柱状艾美耳球虫(E.cylindrica)、奥博艾美耳球虫(E.auburnensis)、怀俄明艾美耳球虫(E.wyomingensis)，伊利诺斯艾美耳球虫(E.illinoisensis)、巴西艾美耳球虫(E.brasiliensis)、皮利他艾美耳球(E.pellita)和布克朗艾美耳球虫(E.bukidnonensis)。但是现今普遍认为牛艾美耳球虫和邱氏艾美耳球虫是对牛致病性最强的两个艾美耳球虫虫种，会引起肠道损伤，导致严重腹泻，甚至死亡。除了这两种球虫外，其他虫种是否具有致病性尚有争议。所以亟需可以准确区分牛感染的不同艾美耳球虫虫种的方法，以确定引起发病的虫种，同时也有助于牛球虫病的精准防控。

目前牛中常见艾美耳球虫的检测和虫种鉴定技术主要有两种，分别是形态学观察和PCR检测。牛中常见的艾美耳球虫虫种在卵囊大小、颜色和形状上具有一定差异，其中部分虫种通过形态学特征加以区分。已有研究者对不同的艾美耳球虫的卵囊和子孢子的形态学数据进行了测量和统计，为其他学者辨认鉴定虫种提供了重要参考。但是，基于形态学的检测和鉴定具有一定的主观性，易造成误判，且通常需要样本中包含大量卵囊，检测灵敏度低、耗时长。近年来，有学者建立了基于PCR的艾美耳球虫分子检测方法，这些方法几乎都是以艾美耳球虫属特异性的核糖体RNA基因的内转录间隔区(Internal TranscribedSpacer，ITS)为目标扩增序列，但不同艾美耳球虫的内转录间隔区的序列长度和多态性差异较大。因此采用艾美耳球虫属特异性的ITS通过PCR对不同虫种的扩增效率存在明显差异，因此采用同一扩增条件进行扩增时常导致无法对某些虫种有效扩增，即导致假阴性出现。而且，现有的艾美耳球虫ITS PCR扩增均为单轮PCR，检测灵敏度较低，无法准确检测卵囊量较低的样本，并且易造成非特异性的扩增。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的巢式PCR方法及试剂盒。

本发明的第一个目的是提供一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的PCR引物。

本发明的第二个目的是提供一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的巢式PCR引物。

本发明的第三个目的是提供所述PCR、巢式PCR引物的应用。

本发明的第四个目的是提供一种用于牛的艾美耳球虫检测和虫种鉴定的方法。

本发明的第五个目的是提供一种用于牛中艾美耳球虫的检测和虫种鉴定的检测试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：