[发明专利]利用CRISPR/dCas9敲低调控蛋白表达以提高TG酶产量的方法

权利要求书

1.一种敲低调控蛋白表达以提高TG酶产量的方法，其特征在于，同时敲低茂源链霉菌C2基因组中调控蛋白编码基因SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调控蛋白编码基因SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720的序列依次如SEQ ID NO.1、NO.2、NO.3、NO.4所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、构建用于同时敲低SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720的CRISPR/dCas9质粒载体I；

S2、将构建得到的CRISPR/dCas9质粒载体I通过接合转移导入受体菌茂源链霉菌C2中进行特异性抑制；

S3、通过安普霉素抗性和PCR验证筛选，得到SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720敲低的突变株。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，质粒载体I的构建包括如下步骤：

A1、设计靶向抑制SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720的sgRNA的20nt序列，通过PCR扩增分别得到含有目标20nt的sgRNA片段，通过Gibson assembly与SpeI/EcoRI双酶切后的整合型质粒pSET-dCas9进行组装，得到4个分别抑制4个基因的质粒；

A2、设计通用质粒pGGA载体和4个sgRNA片段的4nt突出末端及引物，PCR扩增分别得到4个片段，将4个sgRNA片段和载体组装到一起；通过PCR将4个sgRNA片段一起扩增下来，通过Gibson assembly与EcoRI/EcoRV双酶切后的pSET-dCas9进行组装，得到同时抑制4个基因的质粒载体I。

5.权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤A1中，抑制SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720的sgRNA的20nt序列依次如SEQ ID NO.5-8所示。

6.权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤A1中，PCR扩增的引物包括：序列如SEQ IDNO.9/10所示的4150-gRNA-F/dCas9-gRNA-R、序列如SEQ ID NO.11/10所示的1792-gRNA-F/dCas9-gRNA-R、序列如SEQ ID NO.12/10所示的3072-gRNA-F/dCas9-gRNA-R、序列如SEQ IDNO.13/10所示的720-gRNA-F/dCas9-gRNA-R。

7.权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤A2中，所述引物包括序列如SEQ ID NO.14/15所示的part1-F/R、序列如SEQ ID NO.16/17所示的part2-F/R、序列如SEQ ID NO.18/19所示的part3-F/R、序列如SEQ ID NO.20/21所示的part4-F/R。

8.权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤A2中，将4个sgRNA片段一起扩增下来采用的是序列如SEQ ID NO.24/25所示的引物GGA-Gibson-F/R。

9.权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤A2中，将4个sgRNA片段和载体组装到一起形成质粒，利用序列如SEQ ID NO.22/23所示的引物pGGA-F/R通过PCR、PstI/NotI双酶切、测序验证该质粒的正确性；通过序列如SEQ ID NO.24/25所示的引物GGA-Gibson-F/R进行PCR、EcoRI/EcoRV双酶切和测序验证质粒载体I正确性。

10.一种高产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌，其特征在于，同时敲低茂源链霉菌C2中的调控蛋白编码基因SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720，即得所述基因工程菌。