[发明专利]一种基于亚甲基蓝的近红外荧光探针及其合成方法和应用

说明书

本发明提供了一种基于亚甲基蓝的近红外荧光探针及其合成方法和应用。所述探针化合物的名称为4‑((7‑(二乙氨基)‑3‑甲酰基‑2‑氧代‑2H‑铬‑4‑基)氧基)苄基3,7‑双(二甲氨基)‑10H‑吩噻嗪‑10‑羧酸盐，英文名称为4‑((7‑(diethylamino)‑3‑formyl‑2‑oxo‑2H‑chromen‑4‑yl)oxy)benzyl‑3,7‑bis(dimethylamino)‑10H‑phenothiazine‑10‑carboxylate。本发明还提供了一种可检测GSH代谢过程的示踪方法，即将所述探针应用于活细胞成像，可通过激光扫描共聚焦显微镜，对GSH在活细胞中代谢SOsubgt;2/subgt;的过程进行动态示踪。该检测方法灵敏度高，方法简便，操作简单。

技术领域

本发明涉及基于亚甲基蓝的近红外荧光探针，具体属于一种基于亚甲基蓝的近红外荧光探针及其合成方法，以及该探针在区分检测硫醇和代谢中的应用。

背景技术

新陈代谢是体内维持生命的一系列有序化学反应的总称。代谢也被称为细胞代谢。化学生物学需要发展新的技术和方法来研究以化学小分子为探针的生命系统信号转导过程中的重要分子事件。随着有机合成技术的改进，制备了基于有机分子的高性能多功能荧光探针，不仅可有效作为生活系统信号通路的视觉荧光追踪，还可作为有效干预生理和病理过程的药物。

生命系统中有一类重要的含硫活性物质，主要是三种生物硫醇，包括同型半胱氨酸(HCy)、半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、二氧化硫(SO₂)和硫化氢(H₂S)。它们在生物体中形成了一个相互交织的网络：Cys参与了各种蛋白质的合成，以及主要的抗氧化剂GSH也是细胞中硫代谢的中心物质。近年来，研究表明，活性含硫分子的浓度和代谢异常与各种疾病密切相关。生物硫醇和硫化氢与心血管疾病密切相关。内源性二氧化硫浓度与癌症的发生和发展密切相关。研究其代谢途径有利于有效的干预，以预防相关主要疾病的发生和发展。

近年来，我们研究小组一直专注于基于有机分子荧光探针的含硫活性物质的化学精确测量和生物成像。特别是，在将多位点反应和多色发射应用于信号通路方面已经取得了一些进展。

在本发明中，我们同时构建了反应位点来进一步区分靶点或检测其代谢物，从而实现多种代谢途径的同时可视化示踪。实现了对三种生物硫醇的区分检测和追踪GSH代谢SO₂的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于亚甲基蓝的近红外荧光探针及其合成方法，以及该探针在区分检测硫醇和代谢中的应用，所述检测应操作简便、灵敏度高，生物相容性好，检出限较低。

本发明提供一种基于亚甲基蓝的近红外荧光探针，化合物的名称为4-((7-(二乙氨基)-3-甲酰基-2-氧代-2H-铬-4-基)氧基)苄基3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪-10-羧酸盐4-((7-(diethylamino)-3-formyl-2-oxo-2H-chromen-4-yl)oxy)benzyl 3,7-bis(dimethylamino)-10H-phenothiazine-10-carboxylate。命名为MB-C，结构式如下：

本发明提供的基于亚甲基蓝的近红外荧光探针的合成方法，包括如下步骤：

1)将丙二酸和苯酚混合物于0℃下缓慢加入三氯氧磷，混合物在115℃加热到氯化氢气体的强释放停止(约1.5小时)，将上层倒入适量水中并用乙酸乙酯萃取3次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，得到浅黄色油状物丙二酸二苯酯；其中投料摩尔比为丙二酸:苯酚:三氯氧磷＝1:2-3:1.2-1.5；

2)将丙二酸二苯酯溶于的甲苯中，再加入3-二乙氨基酚，回流反应7小时后，抽滤，用石油醚或者正己烷洗涤，产物真空干燥，得到浅黄色固体7-(二乙氨基)-4-羟基-2H-铬烯-2-酮；其中投料摩尔比为丙二酸二苯酯:3-二乙氨基酚＝1:1-1.2；