[发明专利]一种人血小板凋亡微囊泡的应用

权利要求书

1.人血小板凋亡微囊泡在制备促进间充质干细胞成骨向分化的制剂中的应用，所述人血小板凋亡微囊泡的制备方法包括以下步骤：

1）体外分离并提纯人血小板；

2）以培养液重悬，加入星形孢菌素诱导血小板凋亡，用于重悬的培养液为含有10%FBS和1%青-链霉素双抗的MEMα培养基；

3）收集上清液，通过梯度离心法分离得到凋亡微囊泡，所述的梯度离心法包括以下步骤：

将所述上清液于4℃，以800g离心10min，取上清液，获得第一离心上清液；

将所述第一离心上清液于4℃、以16000离心30min，取沉淀物，获得第二离心上清液；即得粗制凋亡微囊泡；

将所述粗制凋亡微囊泡以无菌PBS洗涤，然后于4℃、以16000g离心30min，获得血小板凋亡微囊泡纯品；

所述凋亡微囊泡呈双面凹的圆盘状，粒径为90-300nm。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的制剂为用于骨缺损修复的制剂。

3.一种骨缺损修复制剂在制备促进间充质干细胞成骨向分化的制剂中的应用，包括PLGA 支架材料,其特征在于，所述PLGA 支架材料表面搭载权利要求1或2中所述人血小板凋亡微囊泡。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的骨缺损修复制剂的构建过程包括以下步骤：

（1）将PLGA支架浸泡在多巴胺溶液中形成pDA膜；

（2）去除未附着的多余的多巴胺分子，得到PLGA /pDA支架；

（3）将PLGA /pDA支架浸泡人血小板凋亡微囊泡溶液中。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下1）-5）：

1）所述PLGA支架直径4 mm，高度2 mm；

2）将PLGA支架浸泡在多巴胺溶液中，37℃振荡培养18 h，形成pDA膜；

3）在超声清洗机中用蒸馏水清洗去除未附着的多巴胺分子，直到水变清；75%乙醇灭菌1 h后，无菌PBS清洗3次；

4）所述多巴胺溶液的浓度为2mg/mL；

5）所述人血小板凋亡微囊泡溶液的浓度为0.5μg/μL。

6.一种骨缺损修复制剂的制备方法，其特征在于,所述制备方法包括在PLGA 支架材料表面搭载权利要求1或2中所述人血小板凋亡微囊泡，其中人血小板凋亡微囊泡促进间充质干细胞成骨向分化。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将PLGA支架浸泡在多巴胺溶液中形成pDA膜；

（2）去除未附着的多余的多巴胺分子，得到PLGA /pDA支架；

（3）将PLGA /pDA支架浸泡人血小板凋亡微囊泡溶液中。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，包括如下1）-5）：

1）所述PLGA支架直径4 mm，高度2 mm；

2）将PLGA支架浸泡在多巴胺溶液中，37℃振荡培养18 h，形成pDA膜；

3）在超声清洗机中用蒸馏水清洗去除未附着的多巴胺分子，直到水变清；75%乙醇灭菌1 h后，无菌PBS清洗3次；

4）所述多巴胺溶液的浓度为2mg/mL；

5）所述人血小板凋亡微囊泡溶液的浓度为0.5μg/μL。