[发明专利]一种具有增强CAR-T细胞抗肿瘤能力的嵌合抗原受体、D-CAR-T细胞及其应用

说明书

本发明提供了一种具有增强CAR‑T细胞抗肿瘤能力的嵌合抗原受体和D‑CAR‑T细胞及其应用，属于细胞治疗技术领域。一种嵌合抗原受体D‑CAR的胞内信号区为CD28‑CD3δ。利用慢病毒介导D‑CAR插入T细胞中，所得D‑CAR‑T细胞具有良好的肿瘤靶向性，能精准、特异地识别并杀伤肿瘤细胞，D‑CAR‑T细胞的穿孔素水平略高于Zeta‑CAR‑T；并且D‑CAR‑T与肿瘤细胞共孵育后能显著提高多种细胞因子水平显著升高，进一步增强CAR‑T细胞的抗肿瘤能力。可见，本发明提供的D‑CAR通过提高CAR‑T细胞中细胞因子的表达量以及穿孔素水平，使CAR‑T细胞在抗肿瘤能力方面大大增强。

技术领域

本发明属于细胞治疗技术领域，具体涉及一种具有增强CAR-T细胞抗肿瘤能力的嵌合抗原受体和D-CAR-T细胞及其应用。

背景技术

CAR-T细胞疗法在治疗恶性血液系统肿瘤方面显示出了令人鼓舞的疗效，然而针对实体瘤，复杂的肿瘤微环境限制了CAR-T细胞的功效，阻碍了CAR-T细胞疗法的广泛使用。CAR-T细胞免疫治疗面临的障碍主要包括CAR-T细胞易耗竭、向肿瘤部位的趋化能力和浸润性差、肿瘤抗原逃逸和异质性以及复杂的免疫抑制肿瘤微环境等问题。为了克服这些局限性并将CAR-T细胞的用途扩大到更广泛的恶性肿瘤，有必要使传统CAR超越常规结构设计出全新的“超级”CAR，让CAR-T细胞具备更强大更完善的“武器装备”。

经典CAR结构由肿瘤抗原结合区、铰链区、跨膜区和细胞内信号区组成。细胞外抗原结合区通常是来自单克隆抗体的单链抗体(scFv)，它以主要组织相容性复合体(MHC)非依赖的方式特异性结合肿瘤抗原。细胞内信号区由触发T细胞激活的信号域组成。第一代CAR只有一个CD3ζ结构域；第二代包含CD3ζ结构域和一个共刺激结构域(CD28或4-1BB)；第三代包含CD3ζ结构域和两个共刺激结构域(CD28+OX40或CD28+4-1BB)；第四代CAR在第二代的基础上添加了促炎症细胞因子和共刺激配体，比如IL-7、IL-12等；第五代CAR也是在二代CAR的基础上，在CD3ζ和CD28信号域之间额外插入源自IL-2受体β链(IL-2Rβ)截短的胞质域和在CD3ζ的C末端融合一段用于结合酪氨酸-XX-谷氨酰胺基序(YXXQ)的STAT3/5(转录因子)序列。

当CAR-T细胞特异性识别结合肿瘤抗原时，可募集酪氨酸激酶(Lck)将ITAM上的酪氨酸残基磷酸化，ITAM的磷酸化随后引起ZAP-70酪氨酸激酶的募集和活化，进而引起LAT、SLP-76、Ras-MAP等下游通路信号分子的活化，使CAR-T细胞激活并杀伤肿瘤细胞。因此，ITAM在CAR-T细胞信号转导中发挥着关键作用。目前已报道的CAR结构大多是以第一代CAR结构为基础，采用包含3个ITAM的CD3ζ作为第一激活信号。虽然都是工程化组合不同信号分子结构域，但仍局限在原始结构域的基础上进行改构。比如使用CD3ζ链信号传导基序的天然序列(包含3个ITAM)，或者使用CD28、4-1BB的胞内信号传导结构域的原始序列，对结构域本身并未做任何工程化改造。特别是CAR设计中最重要的CD3ζ第一信号结构域，几乎全都是包含3个ITAM的胞内全长序列。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新型的具有增强CAR-T细胞抗肿瘤能力的嵌合抗原受体D-CAR和D-CAR-T细胞应用。

本发明提供了一种具有增强CAR-T细胞抗肿瘤能力的嵌合抗原受体D-CAR，所述D-CAR的胞内信号区为CD28-CD3δ。

优选的，所述CD28-CD3δ的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述D-CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供了一种编码所述嵌合抗原受体D-CAR的DNA序列，所述DNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明提供了一种表达嵌合抗原受体D-CAR的重组载体，包含所述DNA序列。