[发明专利]一种创制抗疫霉根腐病大豆新种质的方法

权利要求书

1.一种创制抗疫霉根腐病大豆新种质的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1、制备胡萝卜培养基：将新鲜的胡萝卜洗净并切成小块，称取100g，用植物组织搅碎机搅碎，加入适量蒸馏水煮沸30min，用3层纱布过滤，将过滤后的胡萝卜汁定容至500mL，加入10g琼脂，120℃高温高压灭菌 20 min，灭菌后的培养基倒入事先已灭菌的平皿中，培养基高度为0.5cm；

S2、供试菌株的培养：菌株为大豆疫霉菌，将大豆疫霉菌取10mm ×10 mm的正方形菌块接种于S1所述胡萝卜培养基，于25℃暗培养7d；

S3、盆栽种植：野生大豆种子破皮处理后，盆栽种植，每盆中分别种植10粒种子，出苗后每盆中都留有生长一致的幼苗5株，在幼苗第一片三出复叶完全展开后，开始叶片接种鉴定；

S4、叶片接种鉴定：在S3所述第一片三出复叶完全展开后将其剪下，置于不锈钢托盘内，盘底放无菌纱布并喷施适量蒸馏水保持纱布湿润，用灭菌后的手术刀在叶片上表面中心位置划出划痕伤口，将S2培养好的大豆疫霉菌切取圆形菌块，将所述圆形菌块覆盖于划痕伤口之上，菌丝面向上，同时用接种空白胡萝卜培养基的划痕叶片作为空白对照，用保鲜膜覆盖托盘，托盘置于温度24℃、光照12h/d、相对湿度100%环境下培养；

S5、野生大豆疫霉根腐病抗性级别的评价：S4处理后的第5天对接种叶片进行病情表型观查，所述病情表型观察的对象为叶片变色程度，并根据所观察到的病情表型计算感病率来确定野生大豆对疫霉根腐病的抗性级别，并对野生大豆的抗性级别进行统计；

S6、抗性资源的确定：根据S5获得野生大豆的抗性级别数据，将对疫霉根腐病的抗性差异显著的野生大豆资源确定为具有抗性的野生大豆；

S7、获得种间杂交后代：以农艺性状优良的栽培大豆材料做为母本，以S6中筛选出具有抗性的野生大豆为父本进行杂交，获得F0代杂交粒，次年种植杂交粒F0并收获F1种子，自F2代起，每个生长季节继续种植上一年收获的种子，并以1粒传的方式收获下一代种子直至F5代；

S8、种间杂交后代疫霉根腐病抗性鉴定：自F2至F5代，每一个世代按S1至S6所述方法进行疫霉根腐病抗性筛选，保留表现为抗疫霉根腐病的植株；

S9、种间杂交后代表型筛选：F2至F5代，结合S8所述抗疫霉根腐病的植株，进一步考查相关性状筛选出抗疫霉根腐病新种质。

2.根据权利要求1所述的一种创制抗疫霉根腐病大豆新种质的方法，其特征在于，S4所述划痕伤口的长度为叶片长度1/3，所述圆形菌块的直径为叶片长度的1/3。

3.根据权利要求1所述的一种创制抗疫霉根腐病大豆新种质的方法，其特征在于，S5所述感病率计算方法为：感病率=感病叶片数/接种叶片总数×100%，所述感病叶片包括叶片变黄、变褐和失绿。

4.根据权利要求1所述的一种创制抗疫霉根腐病大豆新种质的方法，其特征在于，S5所述抗性级别包括抗病（R）、中间型（I）、感病（S），所述抗病（R）感病率为0.1-30.0%，所述中间型（I）感病率为30.1-70.0%，所述感病（S）感病率为70.1-99.9%。

5.根据权利要求1所述的一种创制抗疫霉根腐病大豆新种质的方法，其特征在于，S7所述野生大豆播种前需进行破皮处理，所述母本晚于父本7-10天播种。

6.根据权利要求1所述的一种创制抗疫霉根腐病大豆新种质的方法，其特征在于，S7所述母本进入盛花期后，选取植株茎上部的发育程度高的花蕾，去除同节位的其它花蕾后用手轻轻捏住花蕾下部，用镊子去掉花蕾的萼片和花冠，然后去掉花药，拴好空白记号牌。

7.根据权利要求1所述的一种创制抗疫霉根腐病大豆新种质的方法，其特征在于，S7所述杂交的授粉方法为：选择当日新开放的花朵，剥开花朵的花瓣，露出花药，将花粉轻轻地涂抹在已去雄的母本花蕾的柱头上，授粉后用新鲜叶片包裹整个去雄花朵，并用牙签固定，在记号牌上做好标注。