[发明专利]一种肝素酶III

说明书

本发明本提供了一种肝素酶III及其编码核苷酸序列、包括该核苷酸序列的重组载体和宿主细胞以及应用，属于基因工程和发酵工程领域。所述肝素酶III包括如Seq ID No.2或Seq ID No.3所示的氨基酸序列，相对于原始的肝素酶III，改造后的肝素酶III的酶活没有下降，稳定性得到增强。

技术领域

本发明涉及基因工程和发酵工程领域，特别涉及一种肝素酶III及其编码核苷酸序列、包括该核苷酸序列的重组载体和宿主细胞以及应用。

背景技术

肝素酶(heparinase)是一类作用于肝素(heparin)或者硫酸乙酰肝素(heparansulfate)的多糖裂解酶，存在于多种微生物中，其中来自肝素黄杆菌的肝素酶最为常见。来自肝素黄杆菌的肝素酶只有三种，分别为肝素酶I(EC 4.2.2.7)、肝素酶II(No EC code)和肝素酶III(EC 4.2.2.8)(Robert J.Linhardt et al.Purification andcharacterization of heparin lyases from Flavobacterium heparinum JBC1992Vol.267：24347-24355)。

肝素酶III主要作用于硫酸乙酰肝素，分子量为73kDa。相比于其他两种肝素酶，研究表明肝素酶III能够作用于胞外基质中的类肝素，产生具有活性的肝素小分子，其能够抑制毛细血管上皮细胞的增殖，从而抑制肿瘤细胞的生长并且减少癌细胞的转移和扩散(LiuDF,Prjasek K,Shriver Z,et al.Heparinase III and uses thereof：United States,US6869789B2[P].205-5-22)。

发明内容

目前肝素酶III稳定性差，很少有通过基因工程手段研究开发出一种在保证酶催化活性的基础上提高酶稳定性的肝素酶III。

针对上述缺陷，本发明的目的在于提供一种肝素酶III及其编码核苷酸序列、包括该核苷酸序列的重组载体和宿主细胞。

本发明提供的一种肝素酶III，所述肝素酶III包括如Seq ID No.2或Seq ID No.3所示的氨基酸序列。

肝素酶III原始氨基酸序列如Seq ID No.1所示。

Seq ID No.2表示氨基酸序列为Seq ID No.1中85、114、403、547位的Q谷氨酰胺全部替换为A丙氨酸。

Seq ID No.3表示氨基酸序列为Seq ID No.1中403位Q谷氨酰胺替换为V缬氨酸，85、114、547位的Q谷氨酰胺处替换为A丙氨酸。

本发明的另一目的为提供一种编码上述肝素酶III的核苷酸序列。

进一步地，所述核苷酸序列如Seq ID No.4或Seq ID No.5所示，其中，Seq IDNo.4为编码Seq ID No.2所述肝素酶III的核苷酸序列，Seq ID No.5为编码Seq ID No.3所述肝素酶III的核苷酸序列。

本发明的又一目的为提供一种重组载体，所述重组载体包含至少一个上述核苷酸序列。

进一步地，所述重组载体为真核细胞重组载体。

更进一步地，所述真核细胞重组载体为pPink-HC、pPICZaA、pPICZ A中的任意一种。

优选地，所述真核细胞重组载体为pPink-HC。

本发明的又一目的为提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述任一重组载体。

进一步地，所述宿主细胞为毕赤酵母。

更进一步地，所述毕赤酵母为X33。