[发明专利]用于试样的光片显微镜检测的方法和装置

说明书

本发明涉及一种用于试样的光片显微镜检测的方法，其中借助照明物镜用光片对试样进行照明，以及本发明涉及一种用于执行该方法的光片显微镜。由试样发射的光借助检测物镜成像到平面状检测器上。在此，检测物镜的光轴与照明物镜的光轴形成不同于0°和180°的角度并且在光片平面中穿过光片。平面状检测器拍摄至少一个图像。本发明还涉及一种相应的光片显微镜。根据本发明，借助神经网络通过分析至少一个图像来确定，(i)光片平面是否至少部分地处于检测物镜的焦平面中，和/或(ii)光片平面沿着检测物镜的光轴位于焦平面的哪个方向上，和/或(iii)沿着检测物镜的光轴测量，光片平面与焦平面距离多远。

技术领域

本发明涉及一种用于试样的光片显微镜检测的方法。在此，借助照明物镜通过光片对试样进行照明。从试样发出的光借助检测物镜而成像到平面状检测器上。在此，检测物镜的光轴与照明物镜的光轴围成不同于0°和180°的角度。光轴在光片平面中穿过光片。在此，平面状检测器拍摄至少一个图像。

背景技术

照明物镜还具有位于光片平面中的光轴。检测物镜的光轴在此优选地垂直于光片平面，但这不是强制性的。一般来说，检测物镜的光轴与光片平面形成不同于0°和对应的180°的角度。光片在其中间部分越厚，角度应越大。

对生物试样的研究在近年来越来越重要，其中，试样的照明通过光片实现，光片的平面(光片平面)与检测的光轴(检测方向)以不为零的角度相交。通常，光片平面在此与检测方向(一般相对于检测物镜的光轴)夹成不为零的、但通常也不一定是直角的角度。这种研究方法主要用在荧光显微成像中并且被归纳为术语LSFM(光片荧光显微术)。示例是在DE10257423A1中描述的以及以上述文献为基础构成的WO2004/0535558A1中描述的而且称为SPIM(选择性平面照明显微术)的方法，利用这种方法，在相对短的时间内也能够产生较厚的试样的三维图像：基于光学剖面，在与沿垂直于剖切平面的方向的相对运动组合下，能够对试样进行可视的/三维拉伸的显示。

相对于其他设计的方法，诸如共焦激光扫描显微术或者双光子显微术，LSFM方法具有多个优点。因为能够实现在宽视场内的检测，所以能够获得更大的试样区域。虽然分辨率略低于共焦激光扫描显微术的情况，但是，能够利用LSFM技术分析较厚的试样，因为透入深度较大。此外，在这种方法中，对试样的曝光是最低的，这降低了试样褪色的风险，因为试样仅受到薄的光片的照射，该薄的光片与检测方向的夹角不为零。

替代纯静置的光片，通过利用光束快速扫描试样也可以产生准静置的光片。光片类型的照明以如下方式产生，光束相对于需要观察的试样经历非常快速的相对运动并且在此，在时间上依次多重地并排排列。在此，相机的在其传感器上成像出试样的积分时间选择成，使得扫描在积分时间内结束。

光片显微术的主要应用之一在于对几百微米直至几毫米的中等大小的生物体进行成像。一般，生物体嵌入凝胶、例如琼脂中，凝胶又处在玻璃毛细管中。玻璃毛细管从上方或从下方被嵌入填入水的试样腔室中，并且试样作为一块被从毛细管中压出。琼脂中的试样被光片照明，并且利用检测物镜(该检测物镜优选地、但是不要一定垂直于光片，进而也垂直于用于产生光片的光学系统的照明物镜)将荧光成像到相机上。

但是，光片显微成像术的方法具有一定局限性。一方面，需要研究的试样相对较大，该试样来自发展生物学。第二方面，由于试样制备和试样腔室的尺寸，光片相对较厚并且进而能够实现的轴向分辨率受到限制。第三，试样的制备很复杂并且不与通常针对单个细胞的荧光显微术的标准试样制备和标准试验保持件相兼容。

为了部分地规避上述限制，在近年来，实现了新型的结构，其中，照明物镜和检测物镜优选彼此垂直而置并且以45°的角度从上方指向试样。操作方式例如在WO2012/110488A1以及在WO2012/122027A1中进行介绍。