[发明专利]一种产L-赖氨酸的枯草芽孢杆菌重组菌的构建及其应用

权利要求书

1.代谢工程改造枯草芽孢杆菌促进L-赖氨酸的合成，其特征在于，所述的重组菌以益生菌B.subtilis ACCC11025为宿主，将B.subtilis中thrD、zwf和gnd用来源C.glutamicum中lysC³¹¹、zwf²⁴³和gnd³⁶¹替换，且B.subtilis中hom替换成来源C.glutamicum中hom⁵⁹，最后再引入C.glutamicum中DapDH改变二氨基庚二酸途径碳分布而促进L-赖氨酸的合成。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌包括B.subtilis XH0、B.subtilis XH1、B.subtilis XH2、B.subtilis XH3、B.subtilis XH4、B.subtilisXH5或B.subtilis XH6。

3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，所述的编码天冬氨酸激酶的基因lysC³¹¹来源于C.glutamicum，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，所述的编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因zwf²⁴³来源于C.glutamicum，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，所述的编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因gnd³⁶¹来源于C.glutamicum，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，所述编码高丝氨酸脱氢酶的hom⁵⁹来源于C.glutamicum，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

7.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，所述的编码二氨基庚二酸脱氢酶基因ddh来源于C.glutamicum，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

8.一种权利要求1～7任一项所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)天冬氨酸激酶基因lysC、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因gnd和高丝氨酸脱氢酶基因hom的替换，以及异源表达DapDH基因ddh：以枯草芽孢杆菌ACCC11025为宿主，采用CRISPR-Cas9系统将基因thrD、zwf、gnd和hom替换为来源于C.glutamicum的lysC³¹¹、zwf²⁴³、gnd³⁶¹和hom⁵⁹，再异源引入C.glutamicum的DapDH基因ddh。

(2)重组质粒构建：以酿脓链球菌的基因组作为模板，将基因Spcas9进行PCR扩增，随后利用限制性内切酶对质粒pHT01和片段Spcas9进行双酶切并酶连，获得目标重组质粒pHT01-Cas9。再将B.subtilis的thrD、zwf、gnd、hom和pksD基因的sgRNA无缝连接到质粒pBE980b，获得五个带有靶向位点的质粒。再将C.glutamicum的lysC³¹¹基因、zwf²⁴³基因、gnd³⁶¹基因、hom⁵⁹基因和ddh基因与B.subtilis的thrD、zwf、gnd、hom和pksD基因的上下同源臂通过融合PCR进行基因融合，再依次酶切连接至质粒pBE980b后得到重组质粒。

(3)重组菌构建：将重组质粒pHT01-Cas9电转至B.subtilisACCC11025感受态细胞中，通过氨苄抗性筛选得到带有Cas9蛋白的转化子。再将其余重组质粒电转至带有Cas9蛋白的B.subtilis ACCC11025感受态细胞中，筛选得到所述的重组菌。