[发明专利]一种具有抗光老化的牙髓间充质干细胞裂解液的制备方法

说明书

本发明提供了提供一种优化的人血小板裂解液培养体系培养牙髓间充质干细胞，从而在低温条件下得到牙髓间充质干细胞裂解液的方法，该方法在操作过程中无需添加任何动物源性物质，安全可靠，并且可以较为快捷且高效地培养扩增人牙髓间充质干细胞。该培养体系获得的牙髓间充质干细胞，经过检测，纯度较高，生长因子含量丰富。本发明通过体外实验发现，牙髓间充质干细胞干细胞不仅可以延缓经过紫外处理的小鼠成纤维细胞的衰老，促进细胞的增殖，还可以增加Ⅰ型胶原的含量，为临床上应用牙髓间充质干细胞裂解液抗光老提供了关键技术。

技术领域

本发明属于牙髓间充质干细胞治疗技术领域，具体涉及一种具有抗光老化的牙髓间充质干细胞裂解液的制备方法。

背景技术

衰老是生物界最基本的自然规律之一，而皮肤衰老作为机体整体衰老的一部分具有特殊意义。皮肤不仅仅人体的第一道防线，皮肤衰老不仅与许多疾病有关，还影响到美观，甚至引发一些心理问题。随着干细胞技术的发展，应用10干细胞进行抗衰老治疗也已经成了一个研究热点。

目前已有文献报通过脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞及其外泌体和裂解液进行抗衰老的研究，并且证实了其疗效。但是因为种子细胞来源和伦理等问题，限制了其在临床上的转化。牙髓间充质干细胞(DPSC)具有来源广、不存在伦理问题等优势，人血小板裂解液培养体系具有安全高效等特点，因此牙髓间充质干细胞裂解液能够更好地满足临床需求。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种具有抗光老化的牙髓间充质干细胞裂解液的制备方法。

本发明采用的技术方案为：

一种具有抗光老化的牙髓间充质干细胞裂解液的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：准备牙髓间充质干细胞；

步骤2：将牙髓间充质干细胞放入添加有人血小板裂解液的α-MEM培养基中培养；

步骤3：将步骤2培养得到的牙髓间充质干细胞重悬于超纯水中，于2～8℃孵育10～30min,存放入-80℃冰箱中，8～24h后取出，于2～8℃解冻，反复冻融3～5次；

步骤4：将步骤3反复冻融得到的细胞悬液在2～8℃以2000-6000g的转速低温离心20～60min，离心后取上清，向上清中加入肝素钠，即可得到牙髓间充质干细胞裂解液。

优选的，在步骤1中，将取出的牙髓组织切成1mm³的组织小块，用含有双抗的PBS叶冲洗3次，然后放入1.5mlEP管中使用中性酶和Ⅰ型胶原酶混合消化20～40min，置于添加有人血小板裂解液的α-MEM培养基中培养，待细胞融合至80％左右后，消化离心，传至第五代。

优选的，其特征在于，添加的中性酶的质量浓度为0.1％～1％，Ⅰ型胶原酶的的质量浓度为0.1～0.8％；添加双抗为50～100U/mL青霉素和50～150ug/mL链霉素。

优选的，在步骤2中，牙髓间充质干细胞在添加有人血小板裂解液的α-MEM培养基中培养36～72h后，更换添加有人血小板裂解液的α-MEM培养基继续培养，并且在后续培养过程中每36～72小时更换一次培养基。

优选的，所述添加有人血小板裂解液的α-MEM培养基中人血小板裂解液的体积浓度为2～10％。

优选的，在步骤3中，重悬牙髓间充质干细胞于超纯水中的细胞浓度为5×10⁶～1×10⁸。

优选的，在步骤4中，所述肝素钠的浓度为2～20IU/ml。

本发明的有益效果：