[发明专利]一种Bt杀虫蛋白对大型蚤安全性影响的评价方法

说明书

本发明揭示了一种Bt杀虫蛋白对大型蚤安全性影响的评价方法，其包括以下步骤：S1)获取大型蚤；S2)配制受试杀虫蛋白溶剂溶液为阴性对照组、重铬酸钾溶液为阳性对照组、受试杀虫蛋白溶液为处理组；S3)配置大型蚤培养液；S4)将大型蚤单只置于器皿中，每器皿添加50mL大型蚤培养液，制备上述三个试验组，每个试验组不少于30个大型蚤；测试过程中，每日添加斜生栅藻饵料，每天观察、记录试验蚤死亡头数、新生幼蚤数并将其移出；试验持续时间为21d，通过对比处理组和对照组大型蚤存活率、产新生幼蚤数指标来评价Bt杀虫蛋白对大型蚤的影响。本发明能够更高效、更准确的体现Bt蛋白对水生生物大型蚤的安全性。

【技术领域】

本发明属于生物安全和转基因作物生态风险评价技术领域，特别是涉及一种Bt杀虫蛋白对大型蚤安全性影响的评价方法。

【背景技术】

将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)中的抗虫基因转入植物基因组后，培育的抗虫转基因植物品种，不仅显著降低虫害对作物产量的影响，增加农民收入，还避免了大量使用化学农药带来的环境污染、害虫产生抗药性等各种弊端，保护人类健康和生态环境平衡。转基因抗虫植物的利用是害虫防治史上一次巨大的绿色变革，已成为害虫防治重要的措施之一。

虽然抗虫转基因植物可以产生很大的经济效益，但也存在很多环境风险和食品安全问题。由于抗虫转基因作物在整个生育期都能表达杀虫蛋白，可能会对直接取食或者间接接触到杀虫蛋白的动物产生影响。与转基因抗虫植物生长的农田环境相邻的沟渠、池塘、湖泊、等自然水域中生活着众多水生生物，转基因抗虫植物在生产过程中可能会使邻近水域中的非靶标水生生物接触到转基因植物及其组织器官；另外，抗虫转基因作物产品已作为饲料原料用于水产养殖，使得水体中的生物暴露于转基因产品之中，因此需要科学的评价转基因作物对水生生物的安全性。

大型蚤(Daphnia magna)作为重要的水生浮游动物，具有生活周期短、繁殖快、易于实验室培养、且实验项目使用的参数在个体间相对恒定等特点，因此常作为模式生物用于水生生态环境评价。目前，评价Bt蛋白对大型蚤的影响通常以表达Bt蛋白的转基因作物为材料(如种子或果实、花粉、叶片)，将转基因作物材料充分粉碎至大型蚤可滤食粒径，随后将粉剂制品添加至大型蚤培养液中，再来调查大型蚤的生物学特性是否发生变化，这种方法至少存在以下不足：(1)转基因作物在营养成分、潜在致敏性、代谢产物等方面存在一些不确定因素，导致评价结果不能直接反应Bt蛋白对大型蚤的影响；(2)需要把转基因作物器官粉粹至大型蚤可以摄食的粒径，材料处理过程中温度过高会导致杀虫蛋白降解；(3)转基因作物受试物容易黏附于大型蚤的触角、壳刺等部位，使大型蚤浮游能力下降甚至死亡，影响评价结果的准确性；(4)转基因作物材料为有机物，加入大型蚤培养液后容易引起水质恶化，增加了培养液的更新频率和大型蚤转移时的机械性损伤。

因此，有必要提供一种新的Bt杀虫蛋白对大型蚤安全性影响的评价方法来解决上述技术问题。

【发明内容】

本发明的主要目的在于提供一种Bt杀虫蛋白对大型蚤安全性影响的评价方法，能够更高效、更准确的体现Bt蛋白对水生生物大型蚤的安全性。

本发明通过如下技术方案实现上述目的：一种Bt杀虫蛋白对大型蚤安全性影响的评价方法，其包括以下步骤：

S1)获取大型蚤：选取培养3代以上遗传背景相同的6～24h孤雌生殖的幼蚤，该幼蚤20℃时重铬酸钾溶液的24h-EC₅₀为0.5～1.2mg/L；

S2)配制受试溶液：分别配置受试杀虫蛋白溶剂溶液A、重铬酸钾溶液B和受试杀虫蛋白溶液C三种受试溶液；其中，所述受试杀虫蛋白溶剂溶液A为阴性对照组，所述重铬酸钾溶液B为阳性对照组，所述受试杀虫蛋白溶液C为处理组；具体包括：

S21)所述杀虫蛋白溶剂溶液A为灭菌蒸馏水或PBS(pH7.4)溶剂(即pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶剂)；