[发明专利]一种小分子药制备成骨微环境的方法及其应用

权利要求书

1.一种小分子药制备成骨微环境的方法，其特征在于：所述方法包括：

步骤一：细胞的复苏与培养；

步骤二：细胞的传代；

步骤三：小分子药短时间范围激活细胞Wnt信号；

步骤四：获得成骨微环境；

所述细胞为骨细胞，包括骨细胞系，原代骨细胞至少一种细胞或两种以上骨细胞组合；

所述成骨微环境为经过上述步骤制备的细胞；

通过持续激活的Wnt信号的骨细胞及其培养上清，或者分泌的囊泡或外泌体，或者脱细胞基质，或者两种或者两种以上的组合，制备成骨微环境并促进细胞成骨分化、矿化，形成骨。而且Wnt信号通路不被长期激活。

2.根据权利要求1所述制备成骨微环境的方法，其特征在于：所述细胞的复苏与培养包括以下步骤：

(1)将含10％胎牛血清、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素的90％α-MEM培养基、胰酶、无菌PBS提前30min放室温备用；

(2)从-80℃中取出骨细胞，立即放入37℃水浴中，快速摇晃1min，令其尽快融化；

(3)从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液至培养皿，加入10ml完全培养基培养，轻轻摇晃均匀放回37℃培养箱；

(4)12小时后吸弃培养液，再加入6ml新鲜完全培养基，放入37℃继续培养，此后两天半量更换新鲜培养基，每次换液时残余之前的培液3ml，加入新鲜培液3ml，根据细胞生长的状态，一般4-5天左右待细胞长到融合度80％-90％时进行传代。

3.根据权利要求2所述制备成骨微环境的方法，其特征在于：所述细胞的传代包括以下步骤：

(1)取需要传代的细胞，吸弃培养液，每个培养皿加入2ml无菌PBS，轻轻摇晃后吸弃，加入1ml预热的胰酶，放入37℃培养箱中消化1-2min，显微镜下观察贴壁细胞呈圆形浮起即可加入1ml完全培养基终止消化；

(2)用5ml移液管轻轻吹打细胞使其脱落，并将细胞收集移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

(3)弃上清，在离心管中加入1ml完全培养基，重悬细胞，计数，以1.5×10⁵cells/mL的密度接种于6孔板，每孔中加入1ml完全培养基，过夜生长12小时待细胞贴壁，生长稳定。

4.根据权利要求3所述制备成骨微环境的方法，其特征在于：小分子药物激活细胞Wnt信号包括：

取出细胞，加入小分子药激活Wnt信号，作用24小时；所述小分子药包括了所有能够激活Wnt信号的药物。

优选地，所述Wnt信号激活的方法，包括生物医用材料、小分子药物、蛋白质、多肽中的一种或两种及以上成分激活经典Wnt/β-catenin信号。

5.根据权利要求4所述制备成骨微环境的方法，其特征在于：所述小分子药为SKL2001，浓度为5-100μM；

优选地，所述SKL2001的浓度为60μM。

6.根据权利要求4或5所述制备成骨微环境的方法，其特征在于：获得成骨微环境包括以下步骤：

(1)Wnt信号激活剂作用细胞24小时，吸弃含SKL2001的培养基；

(2)加入无菌PBS清洗细胞2-3次后加入不含Wnt信号激活剂的完全培养基；

(3)将细胞按照上述传代方法消化。

7.一种成骨微环境，其特征在于：所述成骨微环境通过权利要求6的方法制备获得。

8.一种成骨微环境在新骨形成中的应用，其特征在于Wnt信号激活的小分子药物连接靶向骨的小分子基团，应用于骨松病人、以及促进老年人骨折愈合、治疗骨不连等。