[发明专利]一种快速区分小肠结肠炎耶尔森氏菌与中间型耶尔森氏菌的检测方法

说明书

本发明公开了一种快速区分小肠结肠炎耶尔森氏菌与中间型耶尔森氏菌的检测方法，利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测小肠结肠炎耶尔森氏菌与中间型耶尔森氏菌的肽指纹图谱，根据两种耶尔森氏菌特征峰的不同，鉴定其特征蛋白，区分小肠结肠炎耶尔森氏菌与中间型耶尔森氏菌。本发明采用的方法比现有的传统生化实验鉴定时间缩短1‑2天，可以快速区分小肠结肠炎耶尔森氏菌与中间型耶尔森氏菌，实现快速检测。该方法自动化程度高，检测时间短，有效降低一线检测人员接触食源致病菌的几率，减少食源致病菌对人和环境污染的风险。

技术领域

本发明涉及一种利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-AssistedLaser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS)技术快速区分小肠结肠炎耶尔森氏菌与中间型耶尔森氏菌的检测方法。

背景技术

小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)的分布很广，可存在于生的蔬菜、乳和乳制品、肉类、豆制品、沙拉、牡蛎、蛤和虾。也存在于环境中，如湖泊、河流、土壤和植被。已从家畜、狗、猫、山羊、灰鼠、水貂和灵长类动物的粪便中分离出该菌。在港湾周围，许多鸟类包括水禽和海鸥可能是带菌者。它能引起一种叫做耶尔森氏菌病(Yersiniosis)的人兽共患病，不但能够感染猪、牛、羊等各类动物，而且被感染的动物排出的粪便中也携带该菌，从而污染人类食用的食品、水源等资源，导致人类发生呕吐、腹泻等不适症状，严重者甚至能够威胁到生命。世界各地陆续报道的由本菌引起的败血症，其死亡率可达34％～50％。并且，由于该菌的生存条件极广，生长温度0℃～44℃，甚至报道在-2℃仍可生存，生长环境pH4.0～pH10.0，可以适应中强酸碱。因此，小肠结肠炎耶尔森氏菌是对人类身体健康具有极大威胁的一种细菌。受到小肠结肠炎耶尔森氏菌污染的食物与正常食物在外形与味觉上没有区别，因此准确、快速地检测食品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌具有十分重要的意义。小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测多采用传统的生化反应实验等，该方法所需时间长，一般情况下需要5-7天，很难满足快速检测的需要。

食品安全国家标准《GB 4789.8-2016食品微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》中，小肠结肠炎耶尔森氏菌典型菌落在CIN-1上为深红色中心，周围具有无色透明圈(红色牛眼状菌落)，菌落大小为1mm-2mm，在改良Y琼脂平板上为无色透明、不黏稠的菌落。中间型耶尔森氏菌(Yersinia intermedia)在平板上形态与小肠结肠炎耶尔森氏菌相似，两者难以区分，生化鉴定鉴定所需时间长、实验步骤繁琐。

随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、分子生物学的不断发展，人们已创建了不少快速的小肠结肠炎耶尔森氏菌检测方法。PCR技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，增菌液中可能含有PCR抑制剂，从而影响PCR的扩增结果。小肠结肠炎耶尔森氏菌和中间型耶尔森氏菌都属于耶尔森氏菌属，文献报道耶尔森氏菌属抗原性复杂，其抗原特性与其它肠杆菌科的抗原成分相似，难以进行属种间特异性鉴别。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速区分小肠结肠炎耶尔森氏菌与中间型耶尔森氏菌的检测方法，以克服现有技术的上述缺点，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。

本发明的主要原理为：利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS)技术检测小肠结肠炎耶尔森氏菌与中间型耶尔森氏菌蛋白图谱，根据两种菌产生的蛋白特征峰达到区分的目的，具体包括下列步骤：

1、小肠结肠炎耶尔森氏菌与中间型耶尔森氏菌的待测样品制备