[发明专利]一种在Rosa26位点定点敲入人源补体调节蛋白小型猪的制备方法有效
| 申请号： | 202210168461.4 | 申请日： | 2022-02-24 |
| 公开（公告）号： | CN114231533B | 公开（公告）日： | 2022-05-06 |
| 发明（设计）人： | 秦川;卢天宇;邓守龙;杨博超;于佳楠;王若琳;徐亚新 | 申请（专利权）人： | 中国医学科学院医学实验动物研究所 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/12;C12N15/85;C12N15/65;C12N15/55;C12N15/877;C12N15/90;A01K67/027 |
| 代理公司： | 北京预立生科知识产权代理有限公司 11736 | 代理人： | 朱萍 |
| 地址： | 100021 *** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 rosa26 定点 敲入人源 补体 调节 蛋白 小型 制备 方法 | ||
1.一种用于有效编辑猪ROSA26基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的编码序列如SEQID NO:4所示。
2.一种靶向猪Rosa26基因内含子1的CRISPR/Cas9系统表达载体，其特征在于，所述表达载体由权利要求1所述的sgRNA和骨架载体px330构成。
3.一种表达人源补体调节蛋白同源重组供体载体，其特征在于，所述同源重组供体载体包含5’端同源臂5’HA、EF1α启动子、人源补体调节蛋白基因hCRP、CMV启动子转录表达的新霉素抗性基因PKG-Neo、3’端同源臂3’HA和/或2A短肽；
所述人源补体调节蛋白基因包括hCD46、hCD55和/或hCD59；
所述2A短肽依次串联hCD46、hCD55和/或hCD59；
所述2A短肽包括T2A短肽和/或p2A短肽；
所述同源重组供体载体为表达hCD46的同源重组供体载体、同时表达hCD55和hCD59的同源重组供体载体或同时表达hCD46、hCD55和hCD59的同源重组供体载体；
所述表达hCD46的同源重组供体载体由5’HA、EF1α、hCD46、PKG-Neo、3’HA依次克隆在pGSI骨架载体得到；
所述同时表达hCD55和hCD59的同源重组供体载体由5’HA、EF1α、hCD55、p2A、hCD59、PKG-Neo、3’HA依次克隆在pGSI骨架载体得到；
所述同时表达hCD46、hCD55和hCD59的同源重组供体载体由5’HA、EF1α、hCD46、T2A、hCD55、p2A、hCD59、PKG-Neo、3’HA依次克隆在pGSI骨架载体得到；
所述5’HA的序列如SEQ ID NO:8所示；
所述EF1α的序列如SEQ ID NO:9所示；
所述hCD46的序列如SEQ ID NO:10所示；
所述T2A的序列如SEQ ID NO:11所示；
所述hCD55的序列如SEQ ID NO:12所示；
所述p2A的序列如SEQ ID NO:13所示；
所述hCD59的序列如SEQ ID NO:14所示；
所述PKG-Neo的序列如SEQ ID NO:15所示；
所述3’HA的序列如SEQ ID NO:16所示。
4.一种用于在Rosa26位点定点敲入人源补体调节基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统包含权利要求2所述的表达载体和权利要求3所述的同源重组供体载体。
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