[发明专利]一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟性别鉴定方法

权利要求书

1.一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟性别鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：在鸸鹋养殖场对鸸鹋雏鸟佩戴好标有编号的脚环标记，然后进行采样，采取幼鸟背部和尾部羽毛各5根，放入低温冷藏盒送往检测的实验室；

S2：将2根羽毛的根部0.5cm处剪下，然后剪碎放入装有180μl组织裂解液TL的1.5ml离心管中，加入20μl的20mg/ml蛋白酶K，立刻涡旋振荡充分混匀，从而得到裂解物；

S3：将裂解物放置在55℃水浴过夜直到组织消化完全，然后加入200μl结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，70℃放置10分钟，待其自然冷却后加入100μl异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，得到混合物；

S4：用1ml的枪头吸取混合物，将混合物加入一个吸附柱AC中，将吸附柱放入收集管中以13000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液，加入200μl抑制物去除液IR，以12000rpm离心30秒，倒掉废液，加入700μl漂洗液WB，以12000rpm离心30秒，倒掉废液，加入500μl漂洗液WB，以12000rpm离心30秒，倒掉废液；

S5：将吸附柱AC放回空收集管中，以13000rpm离心2分钟，去除漂洗液，然后取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μl洗脱缓冲液EB，室温放置3-5分钟；

S6：然后以12,000rpm离心1分钟，然后丢弃吸附柱AC，保留含DNA溶液的离心管，用核酸蛋白测定仪对 DNA进行浓度测定，从而得到提取的基因组DNA，对提取的基因组DNA进行保存；

S7：根据鸸鹋Z和W染色体的差异短序列设计2对引物来区分雌雄，所述两对引物由一条共用的上游引物Emu-SD1、两条下游引物Emu-SD2和Emu-SD3组成，引物Emu-SD2对应的区域仅存在于W染色体上，为雌性鸸鹋所特有，然后在引物Emu-SD2区域的上游和下游各选取了一个Z、W序列相同区作为引物Emu-SD1和引物Emu-SD3的设计区，所设计的引物Emu-SD1的序列为AGCTGCTTTGCTACTGCTTTATCCT，引物Emu-SD2的序列为AATGAGTGTCTCAGTACTCCTTTG，引物Emu-SD3的序列为TAGGAATTAATTACTCAGGTAAAAC；

S8：然后进行PCR反应，PCR 反应体系共50μl，所述反应体系如下：

鸸鹋基因组DNA 1μl

10μM Emu-SD1、2和3 各 1μl

2x EasyTaq PCR SuperMix 25μl

H₂O 21μl

PCR 反应条件如下：

①预变性： 94℃ 5min

②变性： 94℃ 30s

③退火： 51℃ 30s

④延伸： 72℃ 40s

⑤终延伸： 72℃ 10min

且②-④循环 35 次；

S9：将PCR 扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，0.5×TBE电泳缓冲液，150V，电泳40min，DNA染料为NA-Red ，紫外下拍照后将电泳条带与DL2000 DNA ladder对比，出现165bp雌性特异性条带的为雌性鸸鹋；缺少165bp雌性特异性条带，且出现1条408bp的扩增条带，为雄性鸸鹋。

2.根据权利要求1所述的一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟性别鉴定方法，其特征在于：所述步骤S1中采样时，采样者需要穿戴一次性手套拔取每只鸸鹋幼鸟背部和尾部羽毛各5根，每次拔羽后，需要使用手套翻转包裹羽毛，用夹子夹紧手套，然后将羽毛连同手套放入低温冷藏盒内进行存放。

3.根据权利要求1所述的一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟性别鉴定方法，其特征在于：所述步骤S5中洗脱缓冲液在使用前，放入65-70℃的水中进行预热。

4.根据权利要求1所述的一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟性别鉴定方法，其特征在于：所述步骤S6中使用到的核酸蛋白测定仪为美国Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白测定仪。

5.根据权利要求1所述的一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟性别鉴定方法，其特征在于：所述步骤S6中提取到的基因组DNA需要在-20℃下进行保存。