[发明专利]一种具有抑菌功能的脱细胞小肠粘膜下层复合骨支架的制备方法

说明书

本发明提供具有抑菌功能的脱细胞小肠粘膜下层复合骨支架的制备方法。所述制备方法包括步骤：(1)取新鲜空肠，切割成若干个长约10‑18cm的肠段反复擦拭去除小肠的黏膜层、肌层和浆膜层。(2)处理后浸泡在0.25％胰蛋白酶溶液中37℃消化24h，蒸馏水漂洗。(3)随后浸入0.5％SDS中37℃持续震荡脱细胞24h，蒸馏水漂洗。(4)随后放置在过氧乙酸的乙醇溶液中浸泡8h，蒸馏水漂洗后低温冷冻干燥，环氧乙烷消毒制得生物基质膜SIS；(5)生物基质膜SIS置于蜂蜜溶液中过夜，随后冷冻干燥，得到脱细胞小肠粘膜下层纳米纤维复合骨支架。本发明的骨支架通过浸渍蜂蜜，不仅获得了抑菌性能，而且该支架具有三维网络结构，具有生物矿化与降解活性及细胞相容性。

技术领域

本发明涉及医用材料技术领域，具体涉及一种具有抑菌功能的脱细胞小肠粘膜下层复合骨支架的制备方法。

背景技术

随着组织工程骨的不断深入研究，制备细胞外基质模拟与自体骨类似的微环境逐渐受到组织工程研究人员的关注。小肠粘膜下层SIS为完全去细胞化的基质膜，主要成分为胶原，它具有大多数胶原产品的共同特性，即较强的韧性。且该胶原仿生了骨胶原的形状与分子结构，主要由有序排列的Ⅰ型胶原纤维组成，这种三维纳米网络结构类似骨3D细胞外基质蛋白。其上分布有粘多糖、蛋白聚糖、糖蛋白、肝素、纤连蛋白和各种功能的增长因子，包括基本成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、转变增长因子factor-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子-1和神经生长因子等，植入人体的SIS几乎没有免疫排斥性。因此，SIS用作组织工程替代材料不仅能起到支撑作用，同时其蕴含的多种生物信息也能调控细胞的各种生命活动和体内组织的修复再生。

SIS作为合成羟基磷灰石(HA)的生物模板，在模拟体液中能够迅速诱导羟基磷灰石的合成。合成的羟基磷灰石具有天然的骨传导性与骨整合能力，骨传导性为血管的长入和新骨的形成提供支架，骨整合特性实现支架与骨组织支架的无纤维结缔组织界面层的直接接触，支架植入后不会发生松动失效。这些特征表明其为骨组织工程中应用前景广阔的生物材料。国内外使用SIS材料作为骨组织工程骨架材料已有一些报道，但一个关键问题使SIS应用受到限制。SIS天然抗菌能力有限，植入体内后，常会伴生感染，引起炎症，如果不能采取有效的抗菌手段，会导致植入失败。

在全球范围内，骨折愈合期间易受到细菌的感染，引发炎症，给患者和医疗系统带来了显著的负担。此外，细菌诱导的感染阻碍了再上皮化和胶原合成，从而挑战骨愈合过程。到2021年，全球抗感染市场估计将达到204亿美元。然而由于抗生素的乱用和滥用，许多细菌产生了耐药菌株，并且其出现频率已超过了抗生素新药的开发速度。由此给疾病的治疗带来了很大的困难。尽管抗菌肽是宿主非特异性免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体的肽类活性物质，是天然免疫的效应分子，不易诱导耐药菌株的产生，抗菌谱广。对高等动物细胞无害，体内无残留，但其抗菌活性远不及传统抗生素。纳米粒子具有适当的抗菌性能，它们也可以作为一个扩散到体内导致小尺寸和严重的健康问题的病人。

发明内容

本发明所要解决的问题是一种绿色合成、操作工艺简单、具有三维网络结构、生物活性与抑菌功能的脱细胞小肠粘膜下层SIS/HONEY复合骨支架的制备方法，旨在通过天然蜂蜜与脱细胞小肠粘膜下层SIS复合的方式，制备出具有抑菌功能的纳米纤维网络结构、可降解、矿化的脱细胞小肠粘膜下层SIS/HONEY复合骨支架。

本发明首先提供一种具有抑菌功能的脱细胞小肠粘膜下层复合骨支架的制备方法：

(1)取屠宰4h内的经过检疫的健康成年家畜的新鲜空肠，用清水反复冲洗干净后，选取管腔粗细相对均匀，管壁无明显破损，无淋巴结附着的部位将其切割成若干个长约10-18cm的肠段，纵向剖开铺平，反复擦拭去除小肠的黏膜层。翻转小肠，用同样的方法去除肌层和浆膜层，用蒸馏水反复漂洗去除小肠粘膜下层上残留的组织；

(2)将机械方法制得的小肠粘膜下层浸泡在0.25％胰蛋白酶溶液中37℃消化24h，蒸馏水反复漂洗。