[发明专利]SP2/0细胞培养基及生产重组犬细小病毒单克隆抗体的方法

说明书

本发明属于细胞培养基技术领域，涉及一种SP2/0细胞培养基及生产重组犬细小病毒单克隆抗体的方法。所述培养基包括氨基酸、维生素、脂类、糖、微量元素、无机盐、细胞因子、次黄嘌呤、胸苷、胆固醇、复合大豆水解物和多胺等添加物。本发明的SP2/0细胞培养基不含血清、无动物源成分，具有成本低廉、安全性高、污染风险小、工艺操作简单、利于产物的纯化、生产批次稳定性等特点，适用于大规模生产，应用于SP2/0细胞的连续灌注培养，可满足规模化工业生产的重组犬细小病毒单克隆抗体养的需求，具有较大的应用前景。

技术领域

本发明属于细胞培养基技术领域，具体涉及一种无血清、化学成分明确的SP2/0细胞培养基，和使用该培养基生产重组犬细小病毒单克隆抗体的方法。

背景技术

犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)感染是犬的一种急性传染病。CPV感染的犬临床表现为出血性肠炎或非化脓性心肌炎，多发生于幼犬，病死率10％～50％；另外，该病毒感染还威胁到实验用犬。目前临床上主要是对症治疗，配合高免血清和单克隆抗体治疗。

当前比较先进的制备犬细小病毒单克隆抗体(Canine parvovirus monoclonalantibody，CPV McAb)的方法是：通过细胞融合技术，将犬细小病毒免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，制备出能分泌抗犬细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，筛选出特异性的杂交瘤细胞，接种生物反应器进行培养，培养液经纯化后制备特异性抗体。

在培养方式上，可用于动物细胞培养的现有技术包括贴壁培养、悬浮培养和灌流培养。在工业化生产中，悬浮培养工艺参数的放大原理和过程控制比其他培养系统更容易理解和掌握，而且具备培养条件均一、细胞收率高、蛋白产量高、可连续在线检测等优点，因此在规模化动物细胞培养生产中多选择悬浮细胞培养工艺。但悬浮培养的主要缺点是细胞悬浮游离生长，生产中细胞培养体积大，设备投入大，相对细胞密度较低。

与传统悬浮培养相比，灌注培养对设备的要求低，空间小更易于放大和工业化生产。尤其是连续灌流培养过程中，新鲜培养基连续地添加，不断地给细胞提供营养，培养上清可以间断或连续地收获，维持了细胞良好的生长环境，提高了反应器中细胞密度，降低了有害代谢产物的累积，延长了细胞的表达时间，从而提高细胞的产量。

由于动物细胞体外培养的复杂性，现有技术中多使用含血清的培养基，以确保细胞高密度生长，实现高产量。中国发明专利CN102120768B中提到了一种用生物反应器生产治疗性犬细小病毒单克隆抗体的方法，从种子复苏到细胞培养，全程采用85％DMEM培养基和15％犊牛血清培养，生产的犬细小病毒单克隆抗体的纯度较高，与传统免疫小鼠制备单抗相比取得了较大的进步，但由于培养基含有动物血清，有潜在的风险，且细胞培养时间较短，批次产量仍然不高，且该专利中收获的培养液犬细小病毒血凝抑制效价仅≥256。

由于在培养基中添加血清有潜在的动物病毒感染的风险，且不利于纯化。因此采用无血清培养基进行灌流培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养不但可降低成本，简化分离纯化步骤，还可避免病毒污染造成的危害。

此外，现有各种商业化的无血清培养基，不但成份不明确，而且对生产不同产物的细胞株适应性各不相同，缺乏广泛的通用性，即便采用稳定的商用无血清培养基，仍需针对每种细胞的生长代谢特性对培养过程进行优化，这个细胞驯化过程往往需要很长时间。目前，采用无血清且化学成分明确的培养基，对SP2/0细胞进行灌注培养并达到高细胞密度以高效生产犬重组犬细小病毒单克隆抗体的方法寥寥无几。

中国发明专利申请CN103773732A中提到了用一种化学成确定的培养基可提高细胞密度并提高目的产物产量，用此培养基在药瓶中培养SP2/0细胞达到的细胞密度峰值为5-6×10⁶cells/mL，培养时长6-7天。该培养基的细胞密度低，产量低，成本高。