[发明专利]制备CAR-T细胞的方法

说明书

本发明涉及制备CAR‑T细胞的方法，该方法包括以下步骤：质粒合成，该质粒是由CD19单链可变区、CD8a铰链区、CD8a跨膜区、4‑1BB信号、CD3ζ的包浆信号、IL‑7、CCL17序列构成；病毒包装，得到慢病毒浓缩液，测定其病毒滴度；T细胞制备，制得T细胞为CD8⁺T细胞，对其进行激活、转导与扩增，收获CAR‑T细胞。本发明还涉及制备T细胞的方法。本发明呈现如说明书所述优异效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分泌IL-7和CCL-17因子，以及分泌中和PD-1和GM-CSF的anti-PD-1与anti-GM-CSFscFv的CD19-CAR-T细胞，本发明还涉及此CAR-T细胞例如CD19-CAR-T细胞的制备方法及其用途。

背景技术

美国食品药品监督管理局(FDA)2017年8月批准了第一个基因治疗产品Kymriah，此产品能够很好的治疗一些患有急性淋巴细胞白血病(ALL)的儿童和年轻人患者。Kymriah是一种基因改良的自体T细胞免疫疗法，即嵌合抗原受体T(CAR-T)免疫疗法。CAR-T免疫疗法是一种以嵌合型抗原受体为基础的细胞免疫治疗方案，通过体外基因转导技术，将编码嵌合抗原受体CAR-T 基因序列导入T细胞中，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性T细胞。最常见的CARs包括了一段抗原识别区，比如单克隆抗体(mAb)的单链可变区段(scFv)，和激活T细胞胞内信号域的TCRζ链。

靶向CD19的CAR-T细胞已经在临床前和临床中表现出惊人的效果，现有研究表明IL-7能延长免疫细胞的存活能力，也能刺激成熟T细胞增殖等，所以IL-7因子可以增强免疫细胞在体内存活时间及抗肿瘤效果；CCL-17也被称作胸腺和活化调节趋化因子，能够提高内源性免疫细胞向肿瘤细胞的聚集能力，进一步增强免疫细胞的抗肿瘤效果。但该疗法却受到其相关毒副作用的限制，如细胞因子释放综合症和神经毒性等。细胞因子综合症主要指免疫细胞与肿瘤细胞作用的过程中，大量释放细胞因子以至于引起进一步的连锁反映，如过度炎症引起的高热寒战、呼吸困难、凝血障碍等，神经毒性引起的头疼、意识模糊、认知改变、语言障碍等症状，最终危及生命。近期，有研究表明单核细胞和巨噬细胞促进CAR-T细胞治疗后的CRS和神经毒性进展，中和巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)能够减缓CAR-T细胞治疗后的CRS及神经毒性，且不会抑制CAR-T的功能(Sterner RM, Sakemura R, Cox MJ. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation butenhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 2019 Feb 14；133(7):697-709. doi: 10.1182/blood-2018-10-881722. Epub 2018 Nov 21.)。利用RNA干扰技术高效率敲低CAR-T细胞内GM-CSF表达或分泌表达中和GM-CSF的anti-GM-CSF scFv，预防或减缓细胞因子释放综合症和神经毒性的发生发展，提高CAR-T疗法的安全性。

在CAR-T细胞治疗肿瘤方面还有肿瘤微环境和免疫应答方面具有十分重要的作用，为了消除肿瘤细胞，需要激活自身免疫系统，免疫细胞的激活与扩增成为消除肿瘤的关键因素，而免疫细胞如T细胞会被肿瘤微环境中免疫检查点分子所抑制，如程序性死亡受体(PD-1)，PD-1在机体中可以下调免疫系统对人体细胞的反映，以及通过抑制T细胞炎症活动来调节免疫系统并促进自身耐受，预防自身免疫性疾病产生，但也可以结合传导抑制性信号，如结合PDL-1配体诱导导致细胞死亡(AICD)产生，限制了体内免疫细胞或CAR-T细胞在体内的持续存在。所以通过PD-1抗体来封闭PD-1免疫检查点，进而修复CAR-T细胞的功能。

本研究团队公开的CN113583143B提供了一种制备CAR-T细胞的优良方法，然而该方法仍然存在值得改进的地方。