[发明专利]三聚泛素链探针及其合成方法和应用

说明书

本发明涉及三聚泛素链探针及其合成方法和应用，具体地，所述三聚泛素链探针具有式I‑a所示的结构或式I‑b所示的结构。本发明的三聚泛素链探针具有更高的拟真性，用其进行去泛素化酶相关功能的研究具有更高的可靠性，进一步可用于研究多聚泛素链水解的外切(exo‑cleavage)和内切(endo‑cleavage)选择性机制。

技术领域

本发明涉及多聚泛素链探针合成和应用领域，具体地，涉及一种三聚泛素链探针及其合成方法和应用。

背景技术

蛋白质泛素化是真核生物体内最为重要的翻译后修饰之一，在许多疾病和生理过程中，如蛋白质酶体降解和DNA损伤修复，扮演着决定性的作用。泛素是一个含有76个氨基酸的翻译后修饰蛋白，其上有7个位点的赖氨酸。在泛素的这些赖氨酸位点以及N端氨基上，也会发生自身泛素化，从而形成包括线性、K6-连接、K11-连接、K27-连接、K29-连接、K33-连接、K48-连接以及k63连接的各种类型多聚泛素链，这些泛素链由于连接方式和结构的差异，在不同的细胞信号通路中行使相关生理功能。K48连接类型的泛素链，是研究最多类型的泛素链，主要作用是将被泛素化的底物蛋白进行蛋白酶体降解。此通路的异常将会导致神经退行性等疾病的发生。

除了泛素化修饰的生成过程外，泛素化修饰也有负调控机制：这些多聚泛素链能够被名为去泛素化酶的泛素水解酶识别，将泛素链从底物蛋白上进行切除，进而调控整个泛素相关的信号通路。目前已有100多种去泛素化酶被发现，这些去泛素化酶维持着细胞信号通路稳定和功能的正常。

荧光标记的泛素探针是一类针对去泛素化酶发展的活性探针，用于研究去泛素化酶解相关机制。对于体内去泛素化机制的研究，能够扩大泛素相关调控机制的认知，并为疾病相关的泛素化靶点进行药物的研制提供基础。目前已经发展的泛素荧光探针有基于单泛素的，例如已经商业化的Ub-AMC、Ub-Rho。也有文章报道基于二泛素的荧光共振能量转移探针，通过在两个泛素上标记荧光对进行能量共振荧光监测，以此对去泛素化酶水解活性和泛素自身结构变化进行检测(J.Am.Chem.Soc.2012,134,3281-3289.Nature,2012,492(7428):266-270.Anal.Biochem.2013,440(1),71-77。ChemBioChem 17.9(2016):816-820.)。但是目前尚未有基于三泛素的荧光探针的合成报道。

发明内容

本发明旨在提供一种合成K48连接类型的三聚泛素链单荧光探针的方法，相较于单泛素链和二泛素链为基础的荧光探针，三泛素的荧光探针含有228个氨基酸的蛋白，由于需要在特定位点引入荧光标记，故无法通过表达的方式获取。而且三聚泛素链荧光探针更能模拟天然状态下的多聚泛素化修饰，多聚泛素链的折叠和结合情况，因此用其进行筛选获得的去泛素化酶活具有更高的保真性。本发明的探针可用于研究多聚泛素链水解的外切(exo-cleavage)和内切(endo-cleavage)选择性机制。由于在生理条件下，泛素化修饰多是以多聚的形式存在，因此使用本发明的三聚泛素链荧光探针更具有拟真性，在此基础上进行泛素化酶或者去泛素化酶的相关功能的研究具有更高的可靠性。

本发明提供一种新的三聚泛素链探针，该新的三聚泛素链探针的结构详见图1，其中，本发明的三聚泛素链探针的三条泛素链的多肽链如下所示：

Distal:

MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG(SEQ ID NO：34)

Middle:

MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFCGK₄₈QLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG(SEQ ID NO：35)

Proximal: