[发明专利]一组特异识别孔雀石绿的单链DNA核酸适配体及其应用

说明书

本发明公开一组特异识别孔雀石绿的单链DNA核酸适配体及其应用，属于食品安全生物技术领域。本发明利用链霉亲和素修饰磁珠辅助分离的Capture‑SELEX指数富集配体系统进化技术，经过9轮的反复孵育、分离亲和序列和无亲和序列、乳化液PCR扩增、制备单链的体外筛选，获得了核酸适配体，验证出3条有亲和力的识别孔雀石绿核酸适配体，从中选出具有亲和力和高特异性的DNA核酸适配体(MG‑36‑12，MG‑36‑16，MG‑36‑17)。将该DNA核酸适配体应用于实际样品的孔雀石绿检测，对水产养殖中孔雀石绿的分析检测具有应用前景。该核酸适配体容易人工合成，方便化学修饰，稳定性好，可长期保存。

技术领域

本发明属于食品安全生物技术领域，经过配体指数富集系统进化技术筛选获得对孔雀石绿具有亲和性和特异性的识别元件，即单链DNA核酸适配体的序列，具体涉及一组特异识别孔雀石绿的单链DNA核酸适配体及其应用。

背景技术

孔雀石绿(Malachite green，MG)是高效而低成本的阳离子型三苯甲烷染料，是治疗真菌、细菌和寄生虫感染的高效能药物。孔雀石绿可用于纸业、纺织业、丙烯酸行业，可作为驱虫药、食品和着色添加剂、医用消毒剂等。在水产品的养殖过程中，很多渔民用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等。作为杀菌剂，孔雀石绿可用作治理鱼类或鱼卵的寄生虫、真菌或细菌感染，例如受真菌Saprolegnia感染的鱼卵和受寄生虫影响的淡水水产。在运输过程中，为了使鳞受损的鱼延长生命，鱼贩也常使用孔雀石绿。孔雀石绿进入水生动物体后经过一系列的代谢变成了隐性孔雀石绿，并在脂肪组织中蓄积，且通过食物链转化进入人体。孔雀石绿具有潜在的致癌、致畸、致突变的作用，因此对人体具有许多不利影响。此外，水产养殖用水中残留的MG也可能对水资源造成严重污染。其在养殖业中的使用未得到美国食品与药物管理局(FDA)的认可；根据欧盟法案2002/675/EC的规定，动物源性食品中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留总量限制为2μg/kg；日本也明确规定在进口水产品中不得检出孔雀石绿残留；我国在农业行业标准《NY5071-2002无公害食品鱼药使用准则》中也将孔雀石绿列为禁用药物。但由于没有低廉有效的替代品，孔雀石绿在水产养殖中的使用屡禁不止。

在水产养殖、水产品运输和售卖过程中添加使用孔雀石绿，一方面水中会有残留，一方面孔雀石绿进入水生动物体内经过一系列生物反应很容易转为毒性更强的隐性孔雀石绿，因此常将二者的总含量作为检测水产品中孔雀石绿残留量的限量指标。目前，检测孔雀石绿的检测分析方法有理化检测和免疫学检测，理化检测包括气相色谱质谱联用法、液相色谱质谱串联检测法、高效液相色谱法、气相色谱法、分光光度法以及薄层层析法；而免疫学检测通常采用酶联免疫检测法，包括了基于生物抗体酶联免疫法、基于仿生抗体的酶联免疫、化学发光免疫法等。理化检测通常需要使用检测仪器价格高，检测费时长，操作人员需要专门培训，操作复杂。免疫学检测针对特殊位点小分子免疫原筛选有一定的难度，制备抗体的成本昂贵，不同批次重复性和稳定性容易受影响，储存条件也比较严苛。免疫胶体金检测技术虽然具有快速、简单，不需要昂贵的检测仪器等优点，但是产品检测结果的准确度不高、灵敏度差。这些检测方法对样品前处理和环境有较高的要求。因此，开发其他快速检测方法检测样品中的孔雀石绿是十分有必要的。