[发明专利]一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在γ-氨基丁酸生产中的应用

说明书

本发明涉及一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在γ‑氨基丁酸生产中的应用，属于生物工程技术领域。本发明所述谷氨酸脱羧酶突变体酶活提高19.8％，同时在60℃孵育24h仍能保持90％的催化活性。以重组谷氨酸棒杆菌的谷氨酸脱羧酶突变体进行转化时，在5L罐中12h分批补料800g底物最终产量高达547.51g/L，比序列如SEQ ID NO.3所述的谷氨酸脱羧酶提高约67.13％，最终底物摩尔转化率达到97.67％。本发明有效提高谷氨酸脱羧酶的酶活以及热稳定性，为工业上高产γ‑氨基丁酸奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是指一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在γ-氨基丁酸生产中的应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)，又名4-氨基丁酸，是一种天然的非蛋白氨基酸，广泛分布在微生物、动物、人体以及植物中。GABA主要作为中枢神经系统的一种抑制性神经递质，具有抗焦虑、降血压、镇定安神、增强记忆、预防肥胖及糖尿病等功能。目前工业上微生物法生产GABA主要是用谷氨酸脱羧酶进行全细胞催化，但由于谷氨酸脱羧酶热稳定性较差，因此提高谷氨酸脱羧酶的酶活以及热稳定性对于工业生产具有重要意义。

谷氨酸棒杆菌是一种革兰氏阳性菌，并且是一种食品级(GRAS)微生物，以谷氨酸棒杆菌为底盘细胞进行工业生产GABA更具有安全性，生产的产品可以广泛应用于食品行业。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在γ-氨基丁酸生产中的应用。本发明以植物乳杆菌GB 01-21为出发菌株进行ARTP诱变得到植物乳杆菌HG-06，以所获得菌株植物乳杆菌HG-06的谷氨酸脱羧酶为亲本的谷氨酸脱羧酶突变体、包含谷氨酸脱羧酶突变体的重组表达载体和重组菌及应用，本发明的谷氨酸脱羧酶突变体酶活及热稳定性均有所提高，将其构建到谷氨酸棒杆菌，全细胞催化效率较高，具有良好的工业前景。

本发明的第一个目的是提供一种谷氨酸脱羧酶，所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列由SEQ ID NO 3所示。

本发明的第二个目的是提供一种谷氨酸脱羧酶突变体，所述谷氨酸脱羧酶突变体氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一个实施例中，编码所述谷氨酸脱羧酶突变体的核苷酸序列由SEQ IDNO.2所示。

本发明的第三个目的是提供一种编码所述的谷氨酸脱羧酶突变体的基因。

本发明的第四个目的是提供一种含有所述谷氨酸脱羧酶突变体的重组表达载体。

在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体以pET-28a、PXMJ-19或PMA5作为表达载体。

本发明的第五个目的是提供一种重组菌，包括所述重组表达载体。

在本发明的一个实施例中，所述重组菌以大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或枯草芽孢杆菌作为宿主菌。

本发明的第六个目的是提供所述的谷氨酸脱羧酶突变体在合成γ-氨基丁酸生产中的应用。

在本发明的一个实施例中，以L-谷氨酸或L-谷氨酸钠为底物，以谷氨酸脱羧酶突变体为催化剂，生产制备γ-氨基丁酸。

在本发明的一个实施例中，合成γ-氨基丁酸的反应条件为25℃-60℃下反应10h以上。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

所述植物乳杆菌HG-06诱变菌株谷氨酸脱羧酶与出发菌株GB 01-21谷氨酸脱羧酶相比具有四个氨基酸残基突变，分别是第72位脯氨酸突变为苏氨酸、第154位丙氨酸突变为苏氨酸、第185位甲硫氨酸突变为缬氨酸以及第412位亮氨酸突变为苯丙氨酸。