[发明专利]温敏雄性不育基因HSP60-3B及其应用和育性恢复的方法

权利要求书

1.一种水稻温敏雄性不育基因HSP60-3B的应用，其特征在于，所述温敏雄性不育基因HSP60-3B编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述的应用具体是，使常规水稻品种中如SEQ ID No.1所示氨基酸序列突变为SEQ ID No.9，进而获得水稻雄性不育株系；所述常规水稻品种为粳稻品种9522；

或，采用CRISPR/Cas9系统定点敲除HSP60-3B基因，抑制编码如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达，获得水稻温敏雄性不育株系；所述CRISPR/Cas9系统定点敲除的方法包括如下步骤：

a) 合成单核苷酸序列，引物如SEQ ID No.3和 SEQ ID No.4所示；

b) 通过退火反应使合成的单核苷酸序列形成二聚体结构，与载体片段进行连接反应，构建含有水稻HSP60-3B基因靶序列的HSP60-3B-sgRNA-Cas9质粒；所述靶序列如SEQ IDNo.13所示；

c）用含HSP60-3B-sgRNA-Cas9质粒的根癌农杆菌侵染水稻品种；

d) 通过将HSP60-3B基因的特异性引物扩增基因组片段进行测序，筛选突变植株。

2.一种水稻温敏雄性不育株系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：选择常规水稻品种，处理，培育，即得所述水稻温敏雄性不育株系，所述处理为，使常规水稻品种中如SEQID No.1所示氨基酸序列突变为SEQ ID No.9，进而获得水稻雄性不育株系；所述常规水稻品种为粳稻品种9522；

或，采用CRISPR/Cas9系统定点敲除HSP60-3B基因，抑制编码如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达，获得水稻温敏雄性不育株系；所述CRISPR/Cas9系统定点敲除的方法包括如下步骤：

a) 合成单核苷酸序列，引物如SEQ ID No.3和 SEQ ID No.4所示；

b) 通过退火反应使合成的单核苷酸序列形成二聚体结构，与载体片段进行连接反应，构建含有水稻HSP60-3B基因靶序列的HSP60-3B-sgRNA-Cas9质粒；所述靶序列如SEQ IDNo.13所示；

c）用含HSP60-3B-sgRNA-Cas9质粒的根癌农杆菌侵染水稻品种；

d) 通过将HSP60-3B基因的特异性引物扩增基因组片段进行测序，筛选突变植株。

3.一种如权利要求2所述的方法获得的水稻温敏雄性不育株系在水稻制种中的用途，其特征在于，所述用途为：在平均温度32℃至34℃条件下，以水稻HSP60-3B不育株系作为母本，进行杂交育种；或，在平均温度22℃条件下，以水稻HSP60-3B株系进行自交制种。

4.一种恢复水稻温敏雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用常规遗传手段将所述HSP60-3B基因转入如权利要求2所述方法获得的水稻雄性不育株系中，进而使得突变体恢复野生型表型；所述HSP60-3B基因编码的氨基酸序列如SEQID No. 1所示。

5.如权利要求4所述的恢复水稻温敏雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：将含HSP60-3B互补构建载体的根癌农杆菌EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中HSP60-3B互补构建载体含有序列如SEQ ID No. 5 所示的核苷酸。

6.如权利要求5所述的恢复水稻温敏雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

(a)从水稻9522基因组中用碱基序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的引物扩增出HSP60-3B基因的基因组序列片段；

(b)提供权利要求5中含HSP60-3B互补构建载体的根癌农杆菌EHA105；

(c)将根据权利要求2所述方法获得的水稻雄性不育株系的细胞、组织或器官与步骤(b)中的农杆菌接触，从而使编码如SEQ ID No. 1所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；

(d)选择转入所述核苷酸的水稻细胞、组织或器官，再生，获得恢复育性的水稻植株。