[发明专利]高产D-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种高产D‑泛酸的基因工程菌株及其构建方法，以及其在微生物发酵制备D‑泛酸中的应用。本发明通过使用来源于pP43NMK的P43启动子和RBS序列置换ilvC、ilvD基因的原有启动子，强化了泛酸合成途径中的α‑酮异戊酸生成量；通过使用来源于pP43NMK的P43启动子和RBS序列置换panB、panE基因的原有启动子，强化了泛解酸的合成；通过使用来源于pP43NMK的P43启动子和RBS序列置换了panD基因的原有启动子，强化了β‑丙氨酸的合成。同时强化glyA和serA基因的表达，增加胞内丝氨酸的水平。由此达到了高产D‑泛酸的目的。

技术领域

本发明涉及一种高产D-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用。

背景技术

在自然界中，泛酸主要存在两种构型：D-泛酸和L-泛酸。在生物体内只有D-泛酸具有生物活性。D-泛酸（D-Pantothenic Acid）又称维生素B5，属于维生素B族水溶性维生素，广泛存在于多种食物中，是人体必需的13种维生素之一。D-泛酸在生物体内可作为辅酶A（CoA）的前体，在几乎所有的生物过程中均发挥着关键作用，推动生物体内的能源代谢和能量交换。泛酸的磷酸化产物巯基乙胺可以合成4-磷酸泛酰巯基乙胺，为辅酶A（CoA）及酰基载体蛋白（ACP） 的组成部分，而CoA及ACP作为构成酰基转移酶的辅酶，广泛参与糖、脂类、蛋白质代谢及肝脏的生物转化作用，对生物体的生长能够起到显著的促进作用。当前发现泛酸只能由植物和微生物合成，动物不能合成泛酸，只能从外界摄取，因此D-泛酸在医药行业、食品工业和饲料工业中的应用有较大潜力。

目前D-泛酸的生产主要有三种方法：化学合成拆分法，生物拆分法以及生物发酵法。化学合成拆分法主要通过两条途径生产D-泛酸：1、以甲醛和异丁醛为起始原料，经醛缩合、腈化以及内酯化等反应生成DL-泛解酸内酯，再进行化学拆分得到D-泛解酸内酯，最后通过与β-丙氨酸钙直接缩合得到D-泛酸钙；2、通过DL-泛解酸内酯与β-丙氨酸钙合成DL-泛酸钙后再诱导结晶，最后通过物理拆分法得到；生物拆分法使用D-立体专一性内酯水解酶水解DL-泛解酸内酯，得到D-泛解酸，再经内酯化反应生成D-泛解酸内酯，最后与β-丙氨酸钙合成得到D-泛酸钙；生物发酵法则是通过添加前体进行发酵，发酵葡萄糖生成D-泛解酸，同时在发酵液中添加β-丙氨酸，最后就可以直接得到D-泛酸。

随着基因工程技术的发展，使用微生物产D-泛酸因其优势日益受到了人们的广泛关注，但利用野生细菌发酵远远不能达到高产D-泛酸的要求，因此需要通过代谢改造的方式来获得高产D-泛酸的工程菌株。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产D-泛酸的基因工程菌株及其构建方法，以及其在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。

本发明采用的技术方案是：

高产D-泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：

（1）以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为底盘菌，将其基因组中的panB基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panB）；

（2）将工程菌Bacillus subtilis（P43-panB）基因组中的panC基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanC）；